HPLC法測定人血漿中5—氟尿嘧啶的濃度

摘要：目的 探討快速測定人血漿中5-氟尿嘧啶濃度的方法。方法 對血漿使用乙酸乙酯兩次提取處理后，采用HPLC法加以測定。結(jié)果 在0.48～61.4μg·mL-1范圍內(nèi)5-氟尿嘧啶血藥濃度線性關(guān)系良好，日內(nèi)RSD為5.12%～9.98%，日間RSD為5.26-10.96%（n=5），且3種濃度的方法回收率均超過85%。樣品在室溫條件、凍存條件、反復(fù)凍融條件下穩(wěn)定性良好。結(jié)論 采用此方法測定人血漿中5-氟尿嘧啶的濃度操作簡便，穩(wěn)定性高，同時還可用于5-氟尿嘧啶的藥代動力學(xué)的研究。

關(guān)鍵詞：HPLC；5-氟尿嘧啶；濃度；測定

5-氟尿嘧啶是尿嘧啶的類似物，常被用于腫瘤的治療。但5-氟尿嘧啶在體內(nèi)的半衰期短，而且毒副反應(yīng)比較大，吸收不規(guī)則。如果藥物在體內(nèi)濃度過高，還會使人發(fā)生毒副反應(yīng)，對人體正常組織也將產(chǎn)生一定的毒性作用。因此，對人血漿中5-氟尿嘧啶的濃度進行測定對于藥動力學(xué)研究具有重要意義。

1 儀器與試劑

儀器包括高效液相色譜儀、XW-80渦旋混合器、B160A型醫(yī)用低速離心機、5417R小型臺式高速離心機、真空離心濃縮儀。試劑為sigma公司生產(chǎn)的5-氟尿嘧啶對照品，水為自制去離子水，其余為分析純。

2 測定方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate C18色譜柱（250mm×4.5mm，5μm）。流動相：10mmol·L-1KH2PO4。柱溫：40℃。流速：1.0mL·min-1。檢測波長：265nm。進樣量：20μL。

2.2 對照品溶液配制 稱取5-氟尿嘧啶對照品30.7mg，放置在25mL量瓶中，然后放入1mL鹽酸，使用蒸餾水定容到刻度，制得對照品溶液。

2.3 血漿樣品處理 對符合要求的患者取血漿100μL，放置在5mL的玻璃試管，再放入2mL乙酸乙酯，震蕩2min后，在離心機上3200r·min-1離心5min，將上層析液放置在另一玻璃試管。然后加入2mL乙酸乙酯，開始第二次提取，震蕩兩分鐘后，在離心機上3200r·min-1離心5min，再次提取上層析液。將兩次提取的析液合并，離心濃縮揮干，然后加入100μL流動相，混合均勻，放置在EP管中，進行10000r·min-1離心7min，取上清液20μL進樣。

2.4 專屬性考察 按照上述方法取空白血漿200μL后，取上清液20μL加以分析，制得空白血漿色譜圖，對空白血漿的干擾情況進行判斷。取5-氟尿嘧啶的對照品20μL加以分析，得到5-氟尿嘧啶對照品的色譜圖，并判斷5-氟尿嘧啶在此方法下的出峰情況。然后將空白血漿與5-氟尿嘧啶對照品混合，同樣按照上述方法，取上清液20μL加以分析，得出血漿+5-氟尿嘧啶對照品色譜圖。

2.5 線性關(guān)系考察 取8份空白血漿，分別加入5-氟尿嘧啶對照品與蒸餾水配置的系列標準液，混合均勻，使血漿藥物濃度分別為0.48、0.96、1.92、3.84、7.68、15.35、30.7、61.4μg·mL-1，按照上述方法對血漿進行處理，分別取20μL進樣，采用HPLC法分析，得到5-氟尿嘧啶不同濃度的峰面積，進行回歸分析，得到回歸方程為Y=0.5422X-0.0918（r=0.9998，n=8）。結(jié)果表明5-氟尿嘧啶在人血漿中的藥物濃度在0.48～61.4μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 回收率試驗 配置5-氟尿嘧啶3種不同濃度的含藥標準血漿，對每個濃度進行5樣本分析，連續(xù)3d分別處理和測定。將得出的峰面積代入標準曲線，計算RSD，求得回收率。

2.7 穩(wěn)定性試驗 配置3組含5-氟尿嘧啶1.92、7.68、30.7mg·L-1的樣品共15個，分別考察在室溫、長期凍存、凍融條件下的穩(wěn)定性。室溫放置1、2、3d，凍存條件為-20℃10、20、30d， 反復(fù)凍融1、2、3次。測得RSD均小于10%。

2.8 樣品質(zhì)量控制 分別配置濃度為1.92、7.68、30.1 mg·L-1的血漿樣品各12份，放置在-20℃條件下備用。檢驗血樣時需同時檢驗3種濃度的樣品。如果相對回收率在85%～115%，檢驗結(jié)果為正常。

3 討論

5-氟尿嘧啶是臨床中常用的抗腫瘤藥物，另外還可用于介入治療胸腹水。測定患者所用藥物的代謝狀況是5-氟尿嘧啶個體化用藥的切入點[1]。5-氟尿嘧啶水溶性強，以往研究顯示，若5-氟尿嘧啶濃度過大，會導(dǎo)致細胞大量死亡，使可供測定的細胞數(shù)量減少；若 5-氟尿嘧啶濃度過小，會導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度過低，無法準確測出[2]。所以采用有機溶劑提取后濃縮更方便提高檢測的靈敏度。

本次實驗顯示，5-氟尿嘧啶的血藥濃度在0.48～61.4μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好，日內(nèi)RSD為5.12～9.98%，日間RSD為5.26%～10.96%（n=5），且不同濃度的方法回收率均能夠大于85%，在室溫、凍存、反復(fù)凍融條件下亦能保持很好的穩(wěn)定性，說明此方法測定5-氟尿嘧啶的血藥濃度操作簡便，準確性和穩(wěn)定性高。

參考文獻：

[1]秦志紅，秦志鳳，趙麗，等. HPLC法測定血漿中5-氟尿嘧啶水平[J].山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，18（04）.

[2]黃燦，許杜娟，夏泉，等.HPLC法測定腫瘤細胞中5-氟尿嘧啶的濃度[J].安徽醫(yī)藥，2012，16（02）.

編輯/蘇小梅