高效液相色譜法同時測定異煙肼、利福平、吡嗪酰胺的實驗研究

摘要：目的 評價高效液相色譜法同時測定異煙肼、利福平和吡嗪酰胺藥物濃度的可行性。方法 采用Water Spherisorb CN 5μm色譜柱；流動相為0.01mol/ml流動相為甲醇：乙腈=55：44，0.01mol/L庚烷磺酸鈉（PH2.2），流速3.0ml/min；柱箱溫度30℃；檢測波長220～400nm；進樣體積10μl；時間范圍15min。結(jié)果 應(yīng)用HPLC法同時測定三種藥物濃度的相對回收率高于95%，絕對回收率均高于85%，且日內(nèi)及日間的RSD均小于8%，符合生物樣本的分析要求。結(jié)論 該方法精密度高，線性關(guān)系好，同時簡單、準確、靈敏度高，為指導(dǎo)臨床用藥提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）；異煙肼；利福平；吡嗪酰胺

異煙肼（INH）、利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）是臨床常用的一線抗癆藥，因其作用機制不同，同時服用可殺滅處于各期的結(jié)核分枝桿菌，臨床中監(jiān)測血藥濃度對結(jié)核病的治療效果起著至關(guān)重要的作用[1，2]。分別測定異煙肼、利福平、吡嗪酰胺一種或兩種的報道較多，但同時測定三種藥物濃度的報道較少[3]，本研究應(yīng)用高效液相色譜法同時測定異煙肼、利福平、吡嗪酰胺的藥物濃度，以期為結(jié)核病的臨床化療提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 日立D-2000高效液相色譜系統(tǒng)（HPLC），Waters CN（5μm），250mm*4.6mm色譜柱，LG10-2.4A高速離心機，電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），超聲波清洗器，精密移液器。

1.2試劑 利福平、異煙肼和吡嗪酰胺標(biāo)準品（北京中科三捷公司），純度分別為99.5%，95.2%、99.5%，異煙肼（INH）、利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）原藥（美國Sigma公司），庚烷磺酸鈉（中國藥品技術(shù)監(jiān)督檢驗所），乙腈、甲醇（上?；瘜W(xué)試劑有限公司），更烷基硫酸鈉（上?；瘜W(xué)試劑有限公司），蒸餾水。

1.3標(biāo)準溶液配制 精密稱取異煙肼（INH）30mg，利福平（RFP）30mg，吡嗪酰胺（PZA）120mg，置于100ml容量瓶中，加入適量甲醇溶解，用蒸餾水稀釋至刻度，濃度分別為INH 300μg/ml，，RFP 300μg/ml，PZA 1200μg/ml，該藥物配比是臨床常用藥物配比。將配置好的標(biāo)準液避光保存于4℃的冰箱中待用。

1.4對比液配制 適量的甲醇用蒸餾水稀釋，置于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，保存于4℃的冰箱中待用。

1.5色譜條件 Water Spherisorb CN 5μm色譜柱；流動相為0.01mol/ml流動相為甲醇：乙腈=55：44，0.01mol/L庚烷磺酸鈉（PH2.2），流速3.0ml/min；柱箱溫度30℃；檢測波長220～400nm；進樣體積10μl；時間范圍15min。

1.6標(biāo)準曲線和線性范圍 精確吸取配制好的標(biāo)準液置于10ml試管，配置成INH、RFP、PZA濃度為0.5μg/ml、0.5μg/ml、2μg/ml；1μg/ml、1μg/ml、4μg/ml；2μg/ml、2μg/ml、8μg/ml；4μg/ml、4μg/ml、16μg/ml；8μg/ml、8μg/ml、32μg/ml。將配置好的溶液用HPLC法測定，以待測液的濃度為橫坐標(biāo)，待測液的峰面積為縱坐標(biāo)，分別求得INH的回歸方程為Y=（X+475.9）/9469；RFP：Y=（X+1705）/6164；PZA：Y=（X+437.6）/17330，r=0.9994，線性關(guān)系良好。INH、RFP在0.5～10μg/ml范圍內(nèi)，PZA在2～40μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2結(jié)果

HPLC法同時測定三種藥物濃度，三種藥物在不同濃度下相對回收率高于95%，絕對回收率均高于85%，且日內(nèi)及日間的RSD均小于8%，符合生物樣本的分析要求。

3結(jié)論

異煙肼分子小，滲透力強，能滲入病變組織和細胞中，對細胞內(nèi)外的結(jié)核桿菌均有很強的殺菌作用，主要的作用機制是抑制結(jié)核桿菌DNA合成；利福平對細胞內(nèi)外代謝旺盛和偶爾繁殖的結(jié)核桿菌均有殺菌作用，常用異煙肼聯(lián)合應(yīng)用，單用極易產(chǎn)生耐藥性；吡嗪酰胺對人型結(jié)核桿菌起抑制和殺滅作用，其抗結(jié)核作用的強弱與環(huán)境酸堿度有關(guān)，在pH5.0～5.5時作用最強[4，5]。細胞內(nèi)環(huán)境為酸性有利于吡嗪酰胺發(fā)揮抗菌作用，因此對干酪樣病灶的結(jié)核桿菌起殺菌作用，但單獨應(yīng)用極易產(chǎn)生耐藥性[6，7]。由于作用機制不同，異煙肼、利福平和吡嗪酰胺同時服用可殺滅各期的結(jié)核分枝桿菌，同時能降低耐藥性的產(chǎn)生，是各種治療方案的常規(guī)用藥[8，9]。

測定異煙肼、利福平、吡嗪酰胺中一種或兩種藥物濃度的方法國內(nèi)、外文獻均有報道[10，11]，但同時測定3種藥物濃度國內(nèi)、外文獻相對很少。因異煙肼、利福平、吡嗪酰胺極性相差極大，其中以異煙肼極性最強，易受內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾[12]。本研究采用0.01mol/ml庚烷磺酸鈉溶液-乙腈（45：55，v/v）作為流動相，并選擇最佳配比，其中乙腈對異煙肼與內(nèi)源性物質(zhì)的分離有重要作用[13]，調(diào)節(jié)pH可修飾峰拖尾，而且采用甲醇沉淀蛋白質(zhì)后，藥物損失少，測定方法簡單方便，回收率高，精密度高，線性關(guān)系好，三種藥物出峰干擾小[14]。

本文中同時測定異煙肼、利福平和吡嗪酰胺濃度的HPLC法，精密度高，線性關(guān)系好，同時方法簡單、準確、靈敏度高，為指導(dǎo)臨床用藥提供了依據(jù)。

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編輯/申磊