全饑餓狀態(tài)對大鼠腦損傷及復(fù)食后學(xué)習(xí)記憶功能的影響

摘要：目的 通過測定血清S100B蛋白，NSE的濃度探討全饑餓狀態(tài)對大鼠腦損傷的影響及大鼠復(fù)食后對其學(xué)習(xí)記憶的影響。方法 采用饑餓大鼠模型，將80只成年健康雄性SD大鼠按體質(zhì)量隨機分成分為兩組，即全饑餓組（A組：n=40），復(fù)食組（B組：n=40）組。A組又分為5個亞組：A-Ⅰ組為正常對照組，A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、A-Ⅴ組分別為全饑餓3 d、5 d、7 d、9 d組，每組n=8。B組也分為5個亞組：B-Ⅰ組為正常對照組，B-Ⅱ、B-Ⅲ、B-Ⅳ、B-Ⅴ組分別為全饑餓3d、5d、7d、9d后給予恢復(fù)進食組組，每組n=8。結(jié)果 A-Ⅱ組、A-Ⅲ組大鼠饑餓后，血清中S100B蛋白含量與NSE含量比較A組均下降，下降幅度 A-Ⅲ組> A-Ⅱ組。其中A-Ⅱ組與對照A-Ⅰ組比較無明顯差別（P>0.05），A-Ⅲ組與A-Ⅰ組比較有差異性（P<0.05）。A-Ⅳ組、A-Ⅴ組血清中S100B蛋白含量與NSE含量比較A-Ⅰ組均上升，但A-Ⅳ組與A-ⅠA組比較無明顯差異（P>0.05），A-Ⅴ組與A-Ⅰ組比較差異明顯（P<0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義。水迷宮實驗中，前6 d定位航行試驗中B-Ⅱ、B-Ⅲ組與對照B-Ⅰ組比較其上臺前平均時間均縮短，其中第1 d和第2 d與對照組比較有明顯差異（P<0.05）。其余無明顯差異（P>0.05）。B-Ⅳ組與對照B-Ⅰ組比較上臺前時間均延長但無明顯差異（P>0.05）。B-Ⅴ組對照B-Ⅰ組比較上臺前時間均延長，其中第1、4 d上臺前時間與對照B-Ⅰ組比較有明顯差異（P<0.05）。饑餓后復(fù)食組平均速度與對照組無差異（P>0.05）。第7 d空間搜索試驗中撤平臺后B-Ⅱ、B-Ⅲ組其站臺穿越次數(shù)大于對照B-Ⅰ組，但是無差異（P>0.05），站臺停留時間百分比大于對照B-Ⅰ組但是無差異（P>0.05）。B-Ⅳ、B-Ⅴ組其站臺穿越次數(shù)小于對照B-Ⅰ組，但是無差異（P>0.05）。站臺停留時間百分比小于對照B-Ⅰ組并且有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 大鼠饑餓3 d、5 d、7 d后無腦損傷發(fā)生，饑餓9 d后有腦損傷發(fā)生。復(fù)食7 d后對其學(xué)習(xí)記憶有一定的影響。

關(guān)鍵詞：饑餓；S100B蛋白；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；水迷宮；酶聯(lián)免疫分析法

近年來，我國礦難的發(fā)生順位發(fā)生了質(zhì)的變化，由原來的瓦斯爆炸事故、井下透水事故、冒頂塌方事故……改變成了井下透水事故、瓦斯爆炸事故、冒頂塌方事故……。因此，冒頂塌方事故發(fā)生后被困員工的生命支持以及各臟器功能的保護則成為了礦山創(chuàng)傷研究的重點。我國井下被困員工持續(xù)時間最長可達25 d。那是2009年7月12日，貴州黔西南州晴隆縣中營鎮(zhèn)新橋煤礦透水事故發(fā)生后，在井下400 m處救出3名礦工，被困井下25 d，計604 h。這些長時間被困井下人員都有一個共同的特點--在有空氣可吸的前提下，有水喝，因無食物供應(yīng)處于全饑餓狀態(tài)。如此長時間饑餓狀態(tài)對腦功能有何影響？被解救和復(fù)食后對腦的復(fù)健又有和影響？是尚未闡明的一個問題，這對于指導(dǎo)井下被困者生命支持和醫(yī)療救治具有重要堵塞意義。本研究則旨在通過實驗研究，初步了解全饑餓狀態(tài)對大鼠腦損傷及復(fù)食后學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1資料與方法

1.1一般資料 成年健康雄性SD大鼠（由河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物中心提供，動物批號：SYXK（冀 2010-0038）80只，體質(zhì)量（319±15）g。按體質(zhì)量隨機分成分為兩組，即全饑餓組（A組：n=40），復(fù)食組（B組：n=40）組。A組又分為5個亞組：A-Ⅰ組為正常對照組，A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、A-Ⅴ組分別為全饑餓3d、5d、7d、9d組，每組n=8。B組也分為5個亞組：B-Ⅰ組為正常對照組，B-Ⅱ、B-Ⅲ、B-Ⅳ、B-Ⅴ組分別為全饑餓3 d、5 d、7 d、9 d后給予恢復(fù)進食組組，每組n=8。

A組大鼠為正常自由飲水、完全斷食后3 d、5 d、7 d、9 d取血測定S100B蛋白和NSE。

B組為A組大鼠為正常自由飲水、完全斷食后3 d、5 d、7 d、9 d給予流質(zhì)飲食，持續(xù)喂養(yǎng)7 d后開始做1次/d水迷宮實驗，共6 d。

1.2方法 實驗期無飼料供應(yīng)自由攝水直至被活殺。饑餓開始當(dāng)日上午處死對照組A-Ⅰ組大鼠。以后分別于饑餓3 d、5 d、7 d、9 d上午同一時間處死A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、A-Ⅴ大鼠。大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺上，在無菌操作條件下剖開腹部用去熱原采血針抽取腹主動脈血4 mL，裝入去熱原的真空采血管內(nèi)，靜置30 min。5000 r/min離心5 min分離血漿后立即將血漿置于-80℃冰箱保存、待測。血漿中S100B蛋白、NSE的測定按照酶聯(lián)免疫分析（ELLSA）法測定。

復(fù)食組對照組B-Ⅰ（n=8）給予正常飲食由流食開始逐漸恢復(fù)正常飲食。B-Ⅱ、B-Ⅲ、B-Ⅳ、B-Ⅴ禁食后由流食開始逐漸恢復(fù)正常飲食。復(fù)食7 d后通過Morris水迷宮及其軟件系統(tǒng)記錄大鼠連續(xù)6 d的定位航行試驗，檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)能力，平臺放在第4象限，記錄潛伏期（大鼠的入水到四肢爬上站臺時所需的時間即上臺前時間），同時記錄大鼠入水后的游泳軌跡及速度，大鼠爬上站臺后，讓其在站臺上站立30 s。若大鼠在入水后120 s內(nèi)未能找到池中的站臺或未能爬上站臺，系統(tǒng)自動停止記錄，潛伏期為120 s，有測試者引導(dǎo)其上臺。在測試第7 d的空間搜索試驗時撤除水池中的平臺，然后將大鼠面向與平臺象限相背象限的迷宮池壁中點放入水中，記錄大鼠在60 s內(nèi)的平臺象限停留百分比以及穿越原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)并記錄大鼠在60 s內(nèi)搜索平臺的軌跡圖，以檢測大鼠對原平臺（目標(biāo)象限）的記憶保持能力。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS17.0軟件包對所得數(shù)據(jù)進行分析，所得實驗數(shù)據(jù)以（x±s）表示。采用多因素方差分析，以P<0.05表示差異存在顯著性。

2結(jié)果

2.1饑餓大鼠各組血清S100B、NSE水平變化規(guī)律 饑餓組血清S100B、NSE水平在饑餓3 d后開始降低，至第5 d降至最低，此后逐漸升高，第9 d升至最高。對照組血清S100B、NSE水平相對穩(wěn)定且不隨時間延長而發(fā)生明顯變化，見表1。

2.2復(fù)食后各組大鼠學(xué)習(xí)記憶實驗結(jié)果 水迷宮實驗中，前6 d定位航行試驗中G、H組與對照F組比較其上臺前平均時間均縮短，其中第1 d和第2 d與對照組比較有明顯差異（P<0.05）。其余無明顯差異（P>0.05）。I組與對照F組比較上臺前時間均延長但無明顯差異（P>0.05）。J組對照F組比較上臺前時間均延長，其中第1、4 d上臺前時間與對照F組比較有明顯差異（P<0.05）。饑餓后復(fù)食組平均速度與對照組無差異（P>0.05）。第7 d空間搜索試驗中撤平臺后G、H組其站臺穿越次數(shù)大于對照F組，但是無差異（P>0.05），站臺停留時間百分比大于對照E組但是無差異（P>0.05）。I、J組其站臺穿越次數(shù)小于對照F組，但是無差異（P>0.05）。站臺停留時間百分比小于對照E組并且有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2～4。

3討論

3.1持續(xù)性全饑餓對腦細胞能夠造成損傷 S100B蛋白是一種酸性鈣結(jié)合蛋白[1]，它在腦組織中含量豐富，遠高于其他組織。其主要功能是膠質(zhì)源性營養(yǎng)作用，調(diào)節(jié)細胞的可塑性，參與信息傳遞，調(diào)節(jié)細胞代謝，調(diào)節(jié)鈣離子濃度等[2-5]。S100B蛋白濃度升高提示細胞壞死或血腦屏障（Blood-brain barrier， BBB）通透性增高， Naeimi 等[6]認為S100B蛋白作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生化標(biāo)志物，其水平變化程度可反映腦膠質(zhì)細胞損傷的嚴重程度。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是糖酵解過程中烯醇化酶的同工酶，NSE在腦組織中含量最高[7]。正常狀態(tài)下NSE在血清、腦脊中含量極低。神經(jīng)元細胞損傷崩解，血腦屏障通透性增加，是血清中NSE水平增高的兩個主要原因，可作為評判顱腦損傷的重要指標(biāo)，且與神經(jīng)元的損傷呈正相關(guān)。本實驗中選用S100B蛋白和NSE兩個生化，既可以反應(yīng)膠質(zhì)細胞損傷，又可以反應(yīng)神經(jīng)元的損傷程度。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全饑餓狀態(tài)下的大鼠，血清腫的 S100B蛋白、NSE水平在3 d后開始降低，至第5 d降至最低，此后反而逐漸升高，第9 d升至最高（P<0.05）。這可能是由于在前期饑餓的應(yīng)激狀態(tài)下，會出現(xiàn)復(fù)雜的神經(jīng)一內(nèi)分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的適應(yīng)性變化，選擇性內(nèi)臟血管痙攣以保持心腦等重要臟器的血液供應(yīng)[8]，腦神經(jīng)元細胞和膠質(zhì)細胞維持正常的基本結(jié)構(gòu)和功能。全饑餓持續(xù)到一定時限，腦細胞則會因代謝紊亂而導(dǎo)致細胞內(nèi)酸中毒-細胞損傷。高濃度的S100B蛋白、NSE又對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用，從而會導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡[9-10]，由此可以推斷，如果大鼠全饑餓狀態(tài)持續(xù)5 d以上，即使給予復(fù)食也則可能遺留學(xué)習(xí)與記憶功能的下降。

3.2全饑餓復(fù)食后對學(xué)習(xí)與記憶的影響 認知功能障礙是腦損傷后最持久的后遺癥，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶、注意和判斷等能力的減弱[11]。水迷宮實驗是經(jīng)典的研究大鼠認知功能的方法。本實驗在大鼠饑餓3、5、7、9 d后，由流食逐漸恢復(fù)飲食，通過預(yù)實驗觀察監(jiān)測復(fù)食至第7 d，動物的外觀、體能狀態(tài)均恢復(fù)至饑餓前的水平，排除了體力等因素對實驗結(jié)果的影響。在本水迷宮實驗中，在平均速度無差異的情況下，前6 d定位航行試驗中G、H組與對照F組比較其上臺前平均時間均縮短，其中第1 d和第2 d與對照組比較有明顯差異（P<0.05）。表明短期饑餓對動物的學(xué)習(xí)過程確實有一定的影響，但對其記憶過程無顯著性影響。這一結(jié)果與饑餓3 d、5 d血清中S100B蛋白、NSE檢測的意義相一致。但饑餓時隨著血糖水平的下降大腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能也明顯下降，有實驗證明低血糖會導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)記憶和辨別功能下降，錯誤增加，可見饑餓對神經(jīng)系統(tǒng)的影響非常明顯[12]。在本實驗中I組與對照F組比較上臺前時間均延長，站臺穿越次數(shù)小于對照F組，但是均無差異，表明饑餓7 d復(fù)食組對大鼠的學(xué)習(xí)記憶均不造成影響，雖然站臺停留時間百分比小于對照F組并且有統(tǒng)計學(xué)意義，可能是因為樣本數(shù)量小的原因。這一結(jié)果與饑餓7 d后血清中S100B蛋白、NSE檢測的意義大致一致。J組對照F組比較上臺前時間均延長，其中第1、4 d上臺前時間與對照F組比較有明顯差異，J組其站臺穿越次數(shù)小于對照F組，站臺停留時間百分比小于對照F組并且差異顯著，表明長期饑餓對大鼠的學(xué)習(xí)記憶有一定的影響。這一結(jié)果與饑餓9 d后血清中S100B蛋白、NSE檢測的意義相一致。由此可見：適度應(yīng)激刺激有助于學(xué)習(xí)記憶功能的提高，當(dāng)人或動物處于強烈的應(yīng)激其學(xué)習(xí)記憶能力會受到明顯的影響，這些結(jié)論也是與Coburn-Litvak[13]等的研究結(jié)果相同。

4結(jié)論

本實驗通過檢測饑餓狀態(tài)下大鼠血清S100B蛋白、NSE水平變化，提示連續(xù)饑餓超過7 d可能發(fā)生腦組織損傷。盡管饑餓9 d后恢復(fù)飲食，亦可對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力遺留不良的影響。

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編輯/張燕