益智健腦顆粒對老年大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位表達(dá)的影響

摘要：目的 觀察益智健腦顆粒對老年大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位表達(dá)的影響。方法 青年對照組（A）10只，為3個月齡大鼠，于取材前1 w購入。20只24個月齡雄性SD大鼠購入后，觀察1w無異常，隨機(jī)分兩組，分別為老年對照組（B）、益智健腦顆粒組（C），各10只。益智健腦顆粒組每天灌藥量10 g/Kg，共30 d；青年對照組與老年對照組給予同體積生理鹽水灌胃。取材時以4℃ 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液大腦灌注固定、制備腦組織切片，免疫組化染色，觀察各組大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位的表達(dá)。結(jié)果 各組大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位在CA1區(qū)、CA3區(qū)表達(dá)存在差異，老年對照組呈弱陽性反應(yīng)，益智健腦顆粒組大鼠海馬M受體亞單位陽性反應(yīng)在CA1區(qū)明顯，在CA3區(qū)表達(dá)相對較弱。結(jié)論 益智健腦顆粒能調(diào)節(jié)膽堿能毒蕈堿M受體的表達(dá)水平，對衰老大鼠海馬的中樞膽堿能系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：益智健腦顆粒；海馬；膽堿能毒蕈堿M受體

從生物學(xué)上講，衰老是生物伴隨時間推移自發(fā)的必然過程，表現(xiàn)為形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的衰退。人在自然衰老時，不同程度會出現(xiàn)記憶力減退、反應(yīng)遲鈍等腦功能障礙癥狀，并隨年齡增長癥狀會越來越嚴(yán)重[1]。研究衰老記憶減退機(jī)制，探尋有效的抗衰老治療途徑，對于實(shí)現(xiàn)健康老齡化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本課題組自2011年開始一直致力于中藥復(fù)方對老年大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)益智健腦顆粒在改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶上有一定療效，現(xiàn)對其可能機(jī)制作進(jìn)一步探討。

1資料與方法

1.1動物 清潔級24月齡健康雄性SD大鼠20只，體重（450±20） g，另于實(shí)驗(yàn)取材前1 w購入3個月齡健康雄性SD大鼠10只，體重體重（250±20） g，動物均由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2藥物 益智健腦顆粒由淫羊藿、何首烏、水蛭、當(dāng)歸、鎖陽、川斷、田七、白芍、刺五加、柏子仁等藥物組成，其水提濃縮液每毫升含生藥3g（湖南德康制藥有限公司）。

1.3試劑 牛血清白蛋白（ 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；小鼠SP檢測試劑盒（ 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；兔抗M1受體多克隆抗體（Santa cruz公司）。

1.4儀器與設(shè)備 Leica-2016型切片機(jī)，德國徠卡儀器有限公司產(chǎn)品；Olympus-BX41顯微鏡，日本；JVCTK-C1381數(shù)字彩色照相機(jī)，日本。

1.5方法

1.5.1分組 20只24個月齡雄性SD大鼠購入后，觀察1 w無異常，隨機(jī)分成兩組：老年對照組﹙10只﹚和益智健腦顆粒組﹙10只﹚。青年對照組﹙10只﹚，為3個月齡雄性SD大鼠，于取材前一周購入。三組大鼠均分籠飼養(yǎng)，﹙25±2﹚℃，濕度50%～60%，自然晝夜節(jié)律，自由飲水，保持室內(nèi)安靜。

1.5.2給藥 益智健腦顆粒組每天灌藥量10 g/Kg，共30 d；青年對照組與老年對照組給予同體積生理鹽水灌胃。

1.5.3組織切片制備 大鼠以10%水合氯醛（0.35ml/100g）進(jìn)行腹腔麻醉，打開腹腔，用止血鉗夾住腹主動脈和下腔靜脈；繼之打開胸腔暴露心臟，用制備的平頭注射針經(jīng)左心室插入升主動脈，用止血鉗夾住心尖部位，然后剪開右心耳，以預(yù)冷的0.9%的生理鹽水快速灌注250 mL左右，沖洗干凈的標(biāo)準(zhǔn)是以肝臟顏色由棕紅色變?yōu)榘咨?。繼而灌注4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛200～300 mL（0.1 M PB配置，pH 7.4），按照先快后慢的速度于40 min內(nèi)灌注完畢。灌注結(jié)束后，迅速開顱取腦，置于4%的多聚甲醛中4℃后固定過夜。第2 d切取包含海馬部位的腦組織塊，移入20%蔗糖溶液（0.1M PB配置，pH 7.4），置冰箱（4℃）待腦組織塊沉底后，再轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液（0.1M PB配置，pH 7.4），待再次沉底后置冰箱（4℃）保存。將腦組織塊行冠狀位冰凍切片，片厚30 μm。每隔5片取1張，每例動物相鄰切片分為3套，每套各5張，選取其中一套進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.5.4免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色步驟如下：（SABC法）①選取冰凍切片于24孔培養(yǎng)板，0.01M PBS漂洗5 min×3次；②現(xiàn)配3%H202室溫30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；③0.01M PBS漂洗5 min×3次；④滴加10%正常山羊封閉血清，室溫濕盒內(nèi)孵育30 min；⑤吸干正常山羊封閉血清，滴加兔抗M1受體多克隆抗體﹙滴度：1∶100﹚工作液，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；⑥0.01M PBS沖洗5 min×3次，加入相應(yīng)生物素化二抗，37℃孵育2 h；⑦0.01M PBS沖洗5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親合素37℃孵育2 h；⑧0.01 M PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色3 min；⑨常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。對照實(shí)驗(yàn)以正常山羊血清和PBS代替一抗，同步進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，最后進(jìn)行顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

用免疫組織化學(xué)染色法顯示的各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)膽堿能毒蕈堿M受體亞單位M1的表達(dá)和分布情況。圖1～2中A，B，C分別為青年對照組、老年對照組和益智健腦顆粒組。從免疫反應(yīng)染色的整體情況看，各組大鼠海馬錐體層細(xì)胞染上了深棕黃色，在錐體細(xì)胞周圍未見其他細(xì)胞有著色。

圖1和圖2分別顯示海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)膽堿能毒蕈堿受體M1的分布特征。M1陽性細(xì)胞的染色反應(yīng)主要集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)，被染成深棕黃色。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上看，青年對照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞均排列整齊緊密，層次結(jié)構(gòu)明顯，突起明顯；老年對照組海馬錐體細(xì)胞排列非常稀疏，輪廓不清，細(xì)胞間隙大，甚至出現(xiàn)缺失，細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)不明顯，染色最淺；益智健腦顆粒組海馬錐體細(xì)胞排列相對緊密，介于上述兩組之間，對M1受體蛋白表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用，層次結(jié)構(gòu)較明顯，染色較深。青年對照組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞均排列非常緊密，層次結(jié)構(gòu)明顯，細(xì)胞核呈現(xiàn)一定反應(yīng)陽性；老年對照組海馬錐體細(xì)胞排列稀疏，有一定的層次性，但輪廓不太清晰，細(xì)胞間隙大；益智健腦顆粒組海馬錐體細(xì)胞排列相對緊密，介于上述兩組之間，細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)模糊，突起明顯，對M1受體蛋白表達(dá)有一定增強(qiáng)作用。

3討論

在研究膽堿能受體的過程中，研究者發(fā)現(xiàn)不同的M受體亞型對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)不完全相同，其中 M1、M4為突觸后受體并引起乙酰膽堿的釋放量增 加[2]。腦衰老時明顯改變的是毒蕈堿受體數(shù)目降低，尤其是M1亞型受體[3]。老年人與老年性癡呆癥患者皮層的海馬膽堿能毒蕈堿受體明顯減少，不同齡大鼠大腦紋狀體區(qū)域的M-AchR數(shù)量也隨年齡而變化，但其結(jié)合能力并無 改變[4]。用放射自顯影方法研究表明，老年大鼠大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體部位M1亞型受體密度顯著低于青年對照鼠，并提出這三個腦區(qū)M1亞型受體密度的降低可能是衰老時學(xué)習(xí)、記憶、聯(lián)想、認(rèn)知等功能障礙的重要機(jī)制之一[5]。大鼠被動逃避反應(yīng)（passive avoidance task，PAT） 訓(xùn)練后立即海馬內(nèi)注射M1、M4受體高選擇性的蛇毒毒素發(fā)現(xiàn)，M1、M4受體促進(jìn)PAT的獲得，提示M1、M4受體對學(xué)習(xí)記憶具有正性調(diào)節(jié)作用[6]。

我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)提出人體進(jìn)入老年，或腎陽漸衰，血行遲緩，血寒而凝；或腎陰虧虛，陰虛燥熱，耗津灼血，血粘成瘀。最終都會形成瘀血停滯，臟腑失于濡養(yǎng)，加速機(jī)體衰老，加重腎虛，日久便逐漸形成\"腎虛導(dǎo)致血瘀；血瘀加重腎虛\"的惡性循環(huán)。腎虛則髓海失養(yǎng)，腦髓漸空； 瘀血阻滯，則氣血無以上榮腦竅。腎虛與血瘀相伴同行，漸致髓?？仗摚駲C(jī)失用，智能減退，發(fā)為癡呆。據(jù)此，為我們以自然衰老大鼠為腎虛血瘀模型，從“補(bǔ)腎活血法”的角度，選取益智健腦方抗衰老研究提供了理論根據(jù)。

益智健腦方由淫羊藿、何首烏、水蛭、當(dāng)歸、鎖陽、川斷、田七、白芍、刺五加、柏子仁等藥物組成。方中淫羊藿、首烏補(bǔ)腎壯陽益精血，共為君藥；當(dāng)歸、水蛭活血化瘀，同為臣藥；田七活血化瘀，川斷補(bǔ)腎行血，鎖陽補(bǔ)腎助陽，少用白芍，利用其酸斂之性，一可防活血有傷血動血之弊，二可佐制補(bǔ)腎藥物之燥性，兼顧陰陽，上述藥物共為佐藥；刺五加補(bǔ)腎安神，柏子仁寧心健腦，共為使藥。諸藥并用，共奏補(bǔ)腎活血之效?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明，中藥益智健腦顆粒通過改善能量代謝、抑制細(xì)胞凋亡、構(gòu)成細(xì)胞骨架、增加激素等多途徑、多靶點(diǎn)治療AD[7]。益智健腦顆粒還能阻止模型鼠BDNF的下調(diào)[8]，改善AD模型鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。本實(shí)驗(yàn)的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬膽堿能毒蕈堿M受體亞單位在CA1區(qū)、CA3區(qū)表達(dá)存在差異，老年對照組呈弱陽性反應(yīng)，益智健腦顆粒組大鼠海馬M受體亞單位陽性反應(yīng)在CA1區(qū)明顯，在CA3區(qū)表達(dá)相對較弱。研究表明益智健腦顆粒能調(diào)節(jié)膽堿能毒蕈堿M受體的表達(dá)水平，對衰老大鼠海馬的中樞膽堿能系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用，這也許是益智健腦顆粒抗衰老的作用機(jī)制之一。

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