回生口服液藥物血清對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞增殖及周期的影響

摘要：目的 觀察回生口服液藥物血清對(duì)人肺癌細(xì)胞A549 增殖及周期的影響。方法 大鼠灌胃制備回生口服液藥物血清，采用MTT 法觀察藥物血清干預(yù)24、48、72 h 后對(duì)細(xì)胞增殖的作用（分為空白組及藥物血清高、中、低劑量組）；采用流式細(xì)胞檢測(cè)分析藥物血清干預(yù)24h 對(duì)細(xì)胞周期的影響（分為空白組、空白組及藥物血清高、中、低劑量組）。結(jié)果 各藥物血清組與空白組之間的吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其吸光度逐漸降低，抑制率逐漸增高（P<0.05）。藥物血清組細(xì)胞周期G1 期增多，G2 期及S 期減少。結(jié)論 益氣化瘀養(yǎng)陰解毒方對(duì)肺癌細(xì)胞具有抑制作用，可能與其抑制細(xì)胞分裂有關(guān)。

關(guān)鍵詞：回生口服液；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549；藥物血清

1 資料與方法

1.1細(xì)胞株、藥物與動(dòng)物 人肺癌A549 細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；回生口服液購(gòu)自成都地奧集團(tuán)天府藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025042；SD 大鼠購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，質(zhì)量200～250g。

1.2主要試劑與儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司），新生牛血清（中科晨宇（北京）貿(mào)易有限公司），胰蛋白酶（Sigma），噻唑藍(lán)（Sigma），二甲基亞砜DMSO（上海卒瑞生物科技有限公司）。低速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），CO2 恒溫孵育箱，倒置生物顯微鏡（Olympus），96 孔培養(yǎng)板（CORNING）， FACSAria 流式細(xì)胞分選儀（美國(guó)BD公司）。

1.3方法

1.3.1藥物血清制備 選用正常成年大鼠16 只，雌雄各半。每日灌胃回生口服液，劑量根據(jù)臨床等效量折算比例換算，分為高、中、低劑量回生口服液組，藥物換算后劑量為低劑量（20mg/kg/d）組、中劑量（40mg/kg/d）組、高劑量（80mg/kg/d）組；空白組大鼠每日灌胃等量生理鹽水。灌胃前12h 禁食不禁水，2次/d，連續(xù)3d 后禁食，于第4d最后1次灌胃1h進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，1800r/min 離心10min，合并同組動(dòng)物血清，用0.22μm微孔濾器過濾除菌，-20℃保存。使用時(shí)以1640 培養(yǎng)基稀釋。

1.3.2人肺癌細(xì)胞的培養(yǎng) 人肺癌A549 細(xì)胞株，用含10%新生牛血清的1640 培養(yǎng)基于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿80%～90%時(shí)開始傳代，約1～2d傳代1 次。

1.4指標(biāo)檢測(cè) 采用MTT法[4-5]。細(xì)胞以含2%新生牛血清的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，胰酶消化， 1640 培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液，濃度5×104/mL，種入96 孔板，每孔200μl細(xì)胞懸液。板周邊的孔以無菌PBS填充，防止邊緣效應(yīng)。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16h后，每組設(shè)5個(gè)平行孔，于24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)，分別加入MTT 溶液20μl繼續(xù)培養(yǎng)4h 后，終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，加入DMSO， 在搖床上輕輕振蕩10min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各吸光度值（A 值），比色時(shí)以空白孔調(diào)零。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）：IR=（空白組A值-給藥組A 值）/對(duì)照組A 值×100%。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，均數(shù)間比較采用方差分析，率的比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖的作用 回生口服液不同濃度藥物血清與空白組之間的細(xì)胞吸光度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率隨之增高（P<0.05）；中劑量組抑制癌細(xì)胞增殖的作用強(qiáng)于低劑量組（P<0.05），見表1。

2.2加藥24h后對(duì)A549 細(xì)胞周期的影響 加藥后24h， 含藥血清組G1 期細(xì)胞數(shù)目比例增多，與空白組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P<0.05），見表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，回生口服液干預(yù)的細(xì)胞組，G1 期細(xì)胞明顯增多，說明該抗腫瘤中藥抑制人肺癌A549 細(xì)胞增殖的機(jī)理可能為阻滯其細(xì)胞分裂，使較多的肺癌細(xì)胞處于分裂抑制的G1期，為進(jìn)一步研究抗復(fù)方中藥的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，課題組下一步擬通過調(diào)控A549增殖的信號(hào)通路切入，探索中醫(yī)藥調(diào)控癌細(xì)胞增殖的詳細(xì)機(jī)制[1-3]。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳煥偉，凌華梅，趙小瓊.回生口服液聯(lián)合地榆升白片輔助治療晚期非小細(xì)胞肺癌的療效觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志2004， 139（22）： 2960-2961.

[2]周繼華.回生口服液治療晚期惡性腫瘤的臨床觀察[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2000，10（6）：346-347.

[3]方喜生，關(guān)明媚，劉國(guó)龍，等.回生口服液預(yù)防非小細(xì)胞肺癌化療所致骨髓抑制觀察[J].中國(guó)中醫(yī)藥咨訊， 2009， 1（6）： 40-41.編輯/哈濤