地中海貧血基因診斷研究

摘要：地中海貧血是一組因珠蛋白肽鏈合成障礙而導(dǎo)致的遺傳性溶血性貧血，目前對地中海貧血尚無有效的治療方法?；蛟\斷是通過對受檢者某一特定基因（DNA）或某轉(zhuǎn)錄物（mRNA）進(jìn)行分析來診斷遺傳病的技術(shù)，已成為最為普遍的地中海貧血常規(guī)檢測方法，又被稱為是診斷地中海貧血的金標(biāo)準(zhǔn)。本文綜述了地中海貧血基因診斷的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：地中海貧血；基因診斷

地中海貧血（Thalassemia）是由于血紅蛋白基因的突變導(dǎo)致珠蛋白鏈的合成不平衡所造成的一類常見的單基因遺傳性、溶血性疾病。包括α地中海貧血和β地中海貧血兩種類型，是世界上最常見和發(fā)病率最高的遺傳性溶血性貧血，也是危害最嚴(yán)重的血紅蛋白病之一。目前對地中海貧血尚無有效的治療方法，因此快捷有效的診斷技術(shù)在地中海貧血干預(yù)中極為重要。隨著分子診斷學(xué)的不斷發(fā)展，特別是基因診斷技術(shù)的應(yīng)用，臨床對地中海貧血的診斷、鑒定變得簡單、準(zhǔn)確[1]，使地中海貧血的基因診斷成為普遍的常規(guī)檢測方法。本文就有關(guān)地中海貧血基因診斷研究進(jìn)展作一綜述。

1 α地中海貧血

α地中海貧血是由于α珠蛋白基因缺失，或非缺失突變導(dǎo)致α珠蛋白鏈功能異常，或合成減少而引起的一種遺傳性溶血性疾病。目前世界上至少發(fā)現(xiàn)了35種缺失，中國人中發(fā)現(xiàn)了7種（3種α+地中海貧血和4種α0地中海貧血），最常見的為東南亞型（--SEA型）。少數(shù)α地中海貧血由基因突變引起，中國人最常見的3種為HbCS、HbQS和HbWM[2]。

1.1跨越斷裂位點(diǎn)PCR（gap-PCR） 這是最常用的針對缺失型突變的檢測方法。在α珠蛋白生成障礙性貧血中，以缺失型常見，除了常見的缺失類型外，也可能存在一些尚未發(fā)現(xiàn)的缺失型珠蛋白生成障礙性貧血，同樣都可以利用gap-PCR技術(shù)進(jìn)行分析和鑒定[3]。李友瓊等[4]運(yùn)用gap-PCR技術(shù)對1例罕見的巴氏水腫胎兒進(jìn)行基因分析鑒定，表明針對大片段缺失的基因型，可以通過在其上、下游設(shè)計特異引物，利用gap-PCR技術(shù)進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)論證實gap-PCR技術(shù)可以用于鑒定未知缺失突變的珠蛋白生成障礙性貧血基因型。

1.2多重PCR（multiplex-PCR，M-PCR）多重PCR是基于gap-PCR原理設(shè)計的PCR技術(shù)，該技術(shù)可快速、準(zhǔn)確檢測α地貧的東南亞缺失（-SEA）、右缺失（-α3.7）和左缺失（-α4.2），具有簡便快速、準(zhǔn)確實用而又經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，非常適合于我國以預(yù)防為主而開展的大人群地中海貧血的分子篩查和臨床樣品的基因診斷[5]。肖奇志等[6]研究提出單管多重PCR和反向斑點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)均能分別準(zhǔn)確檢出常見缺失型和非缺失型α-地貧各種突變類型，如將兩者結(jié)合分析，還能提供相互佐證的重要信息，表明單管多重PCR結(jié)合RDB技術(shù)同時應(yīng)用于α-地貧的基因診斷，可保證產(chǎn)前診斷的可靠性。

1.3實時熒光定量PCR（realtime PCR）該技術(shù)原理是在PCR反應(yīng)體系中加人熒光基團(tuán)，在特定的定量PCR儀上完成，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進(jìn)程，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[7]。該方法具有檢測快速、通量高、操作簡便、不易污染等優(yōu)點(diǎn)。彭建明等[8]通過將多重?zé)晒舛縋CR法與常用的gap -PCR法進(jìn)行比較，無論是對正常標(biāo)本還是對缺失型α地貧基因型的標(biāo)本，檢測結(jié)果都表現(xiàn)出100%的準(zhǔn)確性，研究表明此方法操作快速準(zhǔn)確，簡單可行，低成本高通量，易于實現(xiàn)自動化及標(biāo)準(zhǔn)化，適應(yīng)大規(guī)模檢測。袁曉文等[9]采用雙重TaqMan實時熒光嵌套PCR技術(shù)檢測50份α地貧SEA缺失已知基因型標(biāo)本，結(jié)果顯示該方法不但能實現(xiàn)其快速分子診斷，而且能準(zhǔn)確判斷受檢標(biāo)本中的外源性污染，從而有效避免假陰性或假陽性誤診。Fallah等[10]建立的用于檢測未知缺失類型α-地貧的實時熒光定量PCR可檢測出72.4%的未知缺失類型α-地貧，不僅可用于檢測α-珠蛋白基因的缺失，還適用于其他類型的基因分型。

1.4多重連接探針擴(kuò)增法（ multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）該技術(shù)是另外一種可選擇的用于檢測未知缺失型地中海貧血的分子診斷技術(shù)。MLPA結(jié)合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)，但也有其局限性：需要精確測量DNA的濃度，樣本容易被污染；MLPA用于檢測基因的缺失或重復(fù)，不適合檢測未知的點(diǎn)突變類型[11]。Liu等[12]建立了以MLPA檢測缺失型（-SEA、-α3.7，-α4.2）及非缺失型（α-CSα、α-QSα）α-地貧的方法，其檢測的結(jié)果完全與多重PCR檢測結(jié)果相一致。陳亞軍等[13]對75份檢出α地貧表型特征樣本采用常規(guī)跨越裂點(diǎn)PCR（gap-PCR）技術(shù)及反向斑點(diǎn)雜交（RDB）法檢測α地貧基因缺失及點(diǎn)突變，采用MLPA技術(shù)檢測α珠蛋白基因缺失；產(chǎn)前診斷采用gap-PCR和MLPA法對胎兒標(biāo)本進(jìn)行α地貧基因缺失檢測。得出結(jié)論：MLPA是α地貧基因缺失常規(guī)gap-PCR檢測方法的有效補(bǔ)充，可防止α地貧基因缺失的漏診及產(chǎn)前診斷中的假陽性或假陰性誤診。

2 β地中海貧血

β地中海貧血的分子基礎(chǔ)是珠蛋白基因的點(diǎn)突變或核苷酸序列缺失，造成β珠蛋白鏈合成的減少或缺如。β珠蛋白基因突變主要分為兩大類：一類是非缺失型突變，包括轉(zhuǎn)錄突變、RN加工突變、翻譯突變、顯性遺傳性β地中海貧血和高度不穩(wěn)定性血紅蛋白、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)突變、起始密碼子突變、非翻譯區(qū)突變、PolyA加合信號的突變。另一類是缺失型突變。目前世界范圍內(nèi)已報道200多種β基因突變類型，中國人中已發(fā)現(xiàn)34種，以 CD17（A→T）、CD41/42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C→T）、-28M（A→G）和CD71-72（+A）5種熱點(diǎn)突變最多見，約占突變類型的90%[14]。

2.1反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot，RDB） 該技術(shù)是目前國內(nèi)外最常用的技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)在于一張雜交膜上可同時篩查多種點(diǎn)突變，從而改變了傳統(tǒng)雜交法一次只能檢測一種突變的方式。尤其適合β地貧這類突變位點(diǎn)較多的遺傳病的檢測。李敏敏等[15]應(yīng)用反向點(diǎn)雜交法檢測出1種新的罕見β地中海貧血突變類型，即位于β珠蛋白exonl的CD27（GCC-GAC）突變。陳碧艷等[16]用同樣的方法檢測出罕見β珠蛋白-86（C>G）基因，豐富了中國人β地中海貧血的突變譜。趙華等[17]將PCR-RDB方法與血紅蛋白電泳聯(lián)合，對100 例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性率為46.8%，研究證實血紅蛋白電泳聯(lián)合基因診斷可以準(zhǔn)確區(qū)分突變類型的純合子、雜合子、雙重雜合子及正?；?，是目前診斷β-地中海貧血患者和杜絕重型地中海貧血患兒出生之有效的實驗方法。

2.2基于實時PCR的溶解曲線分析 近年來，基于實時PCR的溶解曲線分析方法檢測地貧的突變基因在臨床上受到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用?；谠摷夹g(shù)主要有二類方法，①基于實時PCR的熒光標(biāo)記探針溶解曲線分析（melting curve analysis，MCA），②高分辨率溶解曲線分析（high resolution melting analysis，HRM）。實時熒光PCR具有靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動化程度高、特異性更強(qiáng)和全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。肖奇志等[18]采用針對我國β地貧24種基因突變的四色MCA試劑盒檢測了187份臨床標(biāo)本，并與PCR-RDB進(jìn)行對照，同時以DNA測序技術(shù)作為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了性能評價；結(jié)果顯示診斷效率大于98%。研究還提出臨床實驗室特別是產(chǎn)前診斷實驗室在采用RDB法檢測β地貧基因突變時，很有必要同時應(yīng)用基于PMCA技術(shù)對檢測結(jié)果進(jìn)行確證，以保證β地貧基因診斷和產(chǎn)前診斷結(jié)果的可靠性。嚴(yán)提珍等[19]也用同一方法檢測了45l份外周血樣本和84份胎兒絨毛、羊水、臍帶血產(chǎn)前診斷樣本，并與PCR-RDB進(jìn)行對照，不一致者用基因測序法驗證，結(jié)果顯示該方法具有很好的診斷特性。廖燦等[20]對30例高風(fēng)險胎兒家系進(jìn)行HRM曲線分析，然后與RDB及DNA測序結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果完全一致，符合率為100%。研究證實基于MCA和HRM方法具有快速、簡便、高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)、性價比高等優(yōu)點(diǎn)，非常適合在臨床上廣泛開展應(yīng)用。

2.3 DNA測序 是最直接最準(zhǔn)確的判斷突變的位置和性質(zhì)的方法，盡管費(fèi)用相對較高，仍然是檢測未知的地貧突變基因的關(guān)鍵方法。通過設(shè)計突變位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR，然后進(jìn)行測序可以確定突變的具體位置和性質(zhì)。目前，基因測序已經(jīng)在地中海貧血稀有突變患者的產(chǎn)前診斷中有所應(yīng)用，潘小英[21]等利用DNA 測序檢測出5種β-地貧稀有基因突變型，分別是beta nt1582（A>G），PolyA（AATAAA>GATAAA）；CD13/14（-C）；beta nt 1586（A>G），PolyA（AATAAA>AATAGA）；IVS-1-1（G>T）；IVS-2-2（-T），其中前2種為新發(fā)現(xiàn)的β-地貧基因突變類型，得出結(jié)論：對常規(guī)基因檢測技術(shù)不能診斷的β-地貧疑似病例，可作DNA測序進(jìn)行確診。宋春林[22]等檢測出CD6、CD56、CD22 三種稀有β地貧突變，研究表明聯(lián)合反向點(diǎn)雜交和直接基因測序技術(shù)可為攜帶稀有β地中海貧血基因突變的夫婦提供產(chǎn)前基因診斷。葉國永[23]等聯(lián)合應(yīng)用MLPA技術(shù)，PCR技術(shù)和基因測序技術(shù)檢測100例臨床樣本，說明MLPA技術(shù)與基因測序技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可用于臨床常規(guī)應(yīng)用。

3結(jié)論

基因診斷是地貧診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。地中海貧血基因診斷技術(shù)經(jīng)過多年的發(fā)展，已成為一項成熟的技術(shù)， 無論從速度、效果、敏感度、自動化程度、分析成本等方面，傳統(tǒng)方法是無法比擬的。目前用于地貧基因診斷的方法較多，本文只敘述了其中幾項，這些方法各有特色和優(yōu)缺點(diǎn)，不同實驗室可根據(jù)自身的技術(shù)優(yōu)勢和經(jīng)驗以及對患者疾病的判斷等因素而考慮使用何種方法?；蛟\斷對操作人員和設(shè)備要求較高，應(yīng)特別注意其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。為提高地中海貧血診斷的準(zhǔn)確性，減少誤診和漏診，應(yīng)將基因診斷法和其他方法有機(jī)結(jié)合起來。相信在不久的將來，地中海貧血的基因診斷技術(shù)將更加成熟、完善。

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編輯/張燕