結(jié)核分枝桿菌MPB64抗原的制備與純化

摘要：根據(jù)GenBank結(jié)核分枝桿菌基因序列設(shè)計引物擴增出MPB64基因，連接至原核表達載體pET32a（+），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，進行SDS-PAGE和Western-blot分析。結(jié)果表明，克隆的MPB64基因同源率為98.36%，重組蛋白以可溶形式在細胞周質(zhì)中表達，大小為24KDa。采用切膠回收水平電泳洗脫純化出的MPB64具有反應(yīng)原性。為進一步研究結(jié)核快速診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牛分枝桿菌；MPB64；原核表達；切膠純化

結(jié)核?。═uberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis TB）引起的一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2012年的數(shù)據(jù)顯示，世界總共有880萬的結(jié)核病患者，相當于每10萬人中就有138個結(jié)核病患者，我國2010年結(jié)核病死亡人數(shù)54000，新發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者869092，復(fù)發(fā)人數(shù)54216，新患者中出現(xiàn)MDR-TB人數(shù)為49000，再次感染的患者出現(xiàn)MDR-TB人數(shù)為14000，結(jié)核患者中得HIV的人數(shù)為145919，HIV患者中出現(xiàn)結(jié)核的人數(shù)為65412，相對于2006年后呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，每年用于結(jié)核的治療費用也從2006年開始遞增，2011年已經(jīng)花費285百萬美元，預(yù)計2012年將花費350百萬美元。

結(jié)核菌素試驗作為最古老的免疫學(xué)試驗方法之一，仍然在使用，對于牛分枝桿菌的特異性抗原的篩選，仍然是診斷中的重點。MPB64抗原是牛分枝桿菌的分泌性抗原，表現(xiàn)為較強的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生和釋放γ干擾素，且MPB64抗原對活動的牛結(jié)核的特異性為100%，敏感性為98.1%[1]，并且發(fā)現(xiàn)部分卡介苗菌株缺MPB64基因[2]，若此用其做皮試，可區(qū)分已患病、隱性感染未發(fā)病和己接種卡介苗的個體，故MPB64可能是最具有潛在應(yīng)用價值的診斷試劑。

1資料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒 E.coli BL21（DE3）由本實驗室保存，表達載體pET32a（+），以及牛結(jié)核分枝桿菌DNA基因組由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室提供。

1.2主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamHI（15U/μL）、EcoR I（15U/μL）、ExTaq DNA聚合酶（5U/μL）、T4鏈接酶均購自大連TaKaRa公司；Marker DL2000、Protein Marker、瓊脂糖、氨芐霉素、IPTG均購自全式金公司；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）為OXOID產(chǎn)品；透析袋和PVDF膜均購自上海索萊寶公司； His-Tag鼠單抗購自Abmart公司；羊抗鼠IgG-HRP（酶標二抗）購自武漢博士德公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒為杭州愛思進生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3引物的設(shè)計 根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的Mycobacterium tuberculosis基因序列基因序列利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，序列如下：上游引物Mpb64-S：5'--TATGGATCCATGCTGGTCACGGCTGTCG --3'，（下劃線為BamH I限制性內(nèi)切酶位點）；下游引物Mpb64-AS：5'--GCGGAATTCCTAGGCCAGCATCGAG

TC--3'（下劃線為RcoR I限制性內(nèi)切酶位點），送由上海生工合成。

1.4 MPB64基因的克隆 取基因組模板1μL，上下游引物各1μL， dNTP 2μL， 10×PCR Buffer2.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL（15U/μL），加入12μLddH2O 補足20μLPCR反應(yīng)體系，PCR條件為94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，擴增30個循環(huán)，72℃最后延伸50 min，1%瓊脂糖凝膠檢測。

1.5原核表達載體的構(gòu)建 將膠回收的目的條帶和載體同時用BamH I和RcoR I分步雙酶切，才后按照摩爾比值5：1建立10μL連接體系，連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），涂板AMP抗性LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性菌落接種與5mlLB培養(yǎng)基住進行小搖，提質(zhì)粒進行BamH I/RcoR I雙酶切鑒定，經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒近一步送測序公司測序。

1.6誘導(dǎo)表達 單個陽性菌落，用5mlLB培養(yǎng)基（含50μg/ml Amp）在37℃搖床培養(yǎng)至OD≈0.7～0.8，然后2%的比例接種至100ml的LB培養(yǎng)基含（50μg/ml Amp），37℃搖床250rpm培養(yǎng)至OD≈0.7～0.8， 此時加入2ml1mol/L IPTG；繼續(xù)37℃搖床200rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，第2d清晨將培養(yǎng)基，12000 rpm 離心1 min，收集菌體，用PBS沖洗2次，加入10mlPBS沖懸菌體，置于液氮罐中反復(fù)凍融3次，此時菌液變透亮再次12000 rpm 離心10 min，獲取上清，加入等倍體積的2×SDS上樣緩沖液充分混勻后煮沸5min，進行SDS-PAGE電泳。

1.7蛋白純化 SDS-PAGE電泳結(jié)束后用預(yù)冷的0.25mol/LKCl浸泡膠至顯示出乳白色的蛋白條帶，切下目的條帶放入透析袋內(nèi)，用夾子將透析袋的兩端夾緊，水平電泳裝置電泳5h，在電泳結(jié)束前，將透析袋換個方向電泳15min。電泳結(jié)束后，收集透析袋內(nèi)的蛋白溶液，12000 rpm 離心5 min所獲上清即為所獲純化蛋白。

1.8 Western blot分析 表達產(chǎn)物和經(jīng)過純化的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳后，按照 3 mm濾紙、SDS-PAGE凝膠、PVDF膜、3 mm濾紙的順序制備三明治，放于Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印儀中，以35 mA轉(zhuǎn)印25min；轉(zhuǎn)膜完成后依次進行進行一抗和二抗的孵育，最后在暗室中進行ECL發(fā)光，觀察結(jié)果。

2結(jié)果

2.1 MPB64基因的克隆 以基因組模板進行PCR，擴增得到了大小約687bp左右的目的條帶（圖1），與預(yù)期大小一致。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a+-mpb64后測序結(jié)果表明，所克隆MPB64基因序列與GenBack發(fā)表的基因序列同源性為98.36%。

3討論

結(jié)核分枝桿菌作為人獸共患結(jié)核病的病原微生物，長久以來一直威脅著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類的健康，鑒于早期診斷的重要性，篩選特異性抗原就顯得尤為重要。結(jié)核分枝桿菌能夠分泌多種保護性抗原成分，如CFP-10，ESAT-6、Aga85b、MPB70、MPB64等等，研究發(fā)現(xiàn)MPT64基因僅存在于 Tb 的 H37Rv，H37Ra，Erdman及BCG 的一些亞株如Tokyo，Moreau，Russian 株之中，而 BCG 的其他亞株 Glaxo，Pasteur，Canadian，Tice，Danish 1331 和麻風(fēng)分枝桿菌則缺乏該基因[3]，并且MPB64作為早期結(jié)核分枝桿菌的特異性分泌蛋白，能夠早期刺激機體產(chǎn)生較高水平的細胞和體液免疫應(yīng)答，是開發(fā)疫苗和早期診斷的理想候選抗原[4-6]。

本實驗成功從結(jié)核分枝桿菌基因組中擴增出MPB64基因，并且成功構(gòu)建原核表達載體pET32a+-mpb64，并成功在大腸桿菌中得到誘導(dǎo)表達。結(jié)果顯示MPB64蛋白為可溶性表達，位于細胞質(zhì)中，大小為24KDa。由于pET32a（+）載體系統(tǒng)帶有His-Tag標簽，經(jīng)過Western-blot分析進一步顯示，24KDa的蛋白條帶有His-Tag標簽，證明了重組蛋白的正確性。本實驗采用了切膠水平洗脫的方法進行簡易制備，結(jié)果顯示切膠法能夠獲得比較純的蛋白，并且純化的蛋白能夠與標準牛陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

最新的報告顯示，全球每過一秒鐘就會產(chǎn)生一名新的結(jié)核病的感染者，如果不加以控制，未來10年內(nèi)估計將會有有3億人受感染。世界衛(wèi)生組織發(fā)布了《2011～2015年遏制結(jié)核病全球計劃：為消除結(jié)核病努力奮斗》的全球行動計劃，這個計劃首次針對全球結(jié)核病治療與研究工作，明確了其中存在的一些缺陷，其主旨是在今后5年內(nèi)遏制結(jié)核病在全球的蔓延，力爭實現(xiàn)減少結(jié)核病死亡人數(shù)，進而根除結(jié)核病的目標。本實驗為進一步建立結(jié)核病新型快速診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Fifis T， Plackett P， Corner L， et al. Purification of a major Mycobacterium bovis antigen for the diagnosis of bovine tuberculosis[J]. Scandinavian journal of immunology，1989：（1），91-101

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[3]孫平，駱旭東，朱道銀，等.MPT64 DNA疫苗對鼠結(jié)核分枝桿菌感染的保護作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004：（19）：1741-1744.

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[6]Roche P， Winter N， Triccas J. et al. Expression of Mycobacterium tuberculosis MPT64 in recombinant Myco. smegmatis： purification， immunogenicity and application to skin tests for tuberculosis[J]. Clinical Experimental Immunology， 1996：（2）：226-232.編輯/申磊