瑞舒伐他汀對(duì)ApoE基因缺陷小鼠主動(dòng)脈SR—AⅠ表達(dá)的影響

摘要：目的 探討瑞舒伐他汀對(duì)ApoE基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化以及主動(dòng)脈AⅠ型清道夫受體（SR-AⅠ）表達(dá)的影響。研究瑞舒伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化（AS）降脂外的可能機(jī)制。方法 20只6 w齡雄性ApoE基因缺陷小鼠隨機(jī)分為高脂模型組、瑞舒伐他汀組，高脂飲食喂養(yǎng)13 w；10只野生雄性小鼠作為正常對(duì)照組，正常飲食喂養(yǎng)13 w。13 w后處死小鼠后取主動(dòng)脈，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色及SR-AⅠ免疫組織化學(xué)染色；另一部分標(biāo)本-80℃保存，提起總蛋白和mRNA，并做Western Blot 和RT-PCR檢測(cè)。觀察主動(dòng)脈血管壁形態(tài)學(xué)變化，定性和定量分析主動(dòng)脈組織清道夫受體1（SR-AⅠ）表達(dá)強(qiáng)度變化。結(jié)果 和正常對(duì)照組相比，高脂模型組主動(dòng)脈粥樣硬化病變程度明顯加重，主動(dòng)脈SR-AⅠ蛋白和mRNA的表達(dá)均明顯增加；和高脂模型組比較，瑞舒伐他汀組主動(dòng)脈粥樣硬化病變程度減輕，SR-AⅠ蛋白和mRNA的表達(dá)均減少。結(jié)論 瑞舒伐他汀可減輕主動(dòng)脈粥樣硬化病變程度并可減少主動(dòng)脈SR-AⅠ的表達(dá)；瑞舒伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化的降脂外作用可能與抑制主動(dòng)脈SR-AⅠ的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：瑞舒伐他?。籄poE基因缺陷小鼠；動(dòng)脈粥樣硬化；AⅠ型清道夫受體

目前他汀類藥物已被公認(rèn)為具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，越來越多的研究表明它在抗動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展方面，除了降脂作用外還有很多調(diào)脂外的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制，而SR-AI在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起著重要的作用，本實(shí)驗(yàn)通過研究瑞舒伐他汀對(duì)主動(dòng)脈SR-AI表達(dá)的影響，探討其調(diào)脂外的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制。

1資料與方法

1.1動(dòng)物 健康野生型雄性小鼠10只、ApoE基因缺陷雄性小鼠20只，體重18.5～21.2 g/只，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥物 瑞舒伐他汀，商品名可定，由阿斯利康制藥有限公司提供。

1.3飼料 基礎(chǔ)飼料及高脂飼料均由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料廠提供。高脂飼料配方：含10%豬油，2%膽固醇 0.2%膽酸鈉 87.8%普通飼料。

1.4光鏡病理試劑均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。ABC免疫組化染色試劑盒、日立7600-010全自動(dòng)生化分析儀、日本歐林巴斯彩色病理圖像分析系統(tǒng)。

1.5方法

1.5.1動(dòng)物分組 正常對(duì)照組（A組）：6 w齡雄性野生型小鼠10只，給普通飼料、飲水喂養(yǎng)；將20只6 w齡APOE基因缺失雄性小鼠隨機(jī)分為二組：高脂模型組10只（B組）：予高脂飲食、飲水；瑞舒伐他汀藥物干預(yù)組10只（C組）：給予高脂飲食、飲水和瑞舒伐他汀10 mg/Kg/d； 三組喂養(yǎng)時(shí)間均為13 w。

1.5.2樣本采集 樣本采集前12 h禁飲禁食，采用眼球摘取采血約1.5 mL，離心取血清。小鼠引頸法處死，開胸剝離主動(dòng)脈全長（從主動(dòng)脈弓起始到腹主動(dòng)脈分支處），生理鹽水沖洗后，放入10%甲醛固定，取主動(dòng)脈弓部動(dòng)脈，常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋、切片，用于常規(guī)形態(tài)學(xué)及免疫組化檢測(cè)。

1.5.3病理觀察 HE染色后光鏡下觀察各組主動(dòng)脈內(nèi)膜病變。

1.5.4免疫組化 檢測(cè)通過ABC法染色，觀察各組主動(dòng)脈血管壁組織SR-AⅠ表達(dá)水平。

1.5.5 Western blot 根據(jù)試劑盒檢測(cè)，觀察各組主動(dòng)脈血管壁組織SR-AⅠ蛋白表達(dá)水平。

1.5.6 RT-PCR 根據(jù)試劑盒檢測(cè)[1]，觀察各組主動(dòng)脈血管壁組織SR-AⅠmRNA表達(dá)水平。

1.5.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較首先行方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊，使用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal Wallis test），方差齊采用方差分析，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動(dòng)脈粥樣硬化程度 正常對(duì)照組小鼠動(dòng)脈血管各層結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜薄，無動(dòng)脈硬化斑塊。高脂飲食組內(nèi)膜明顯增厚，脂質(zhì)斑塊彌漫，泡沫細(xì)胞大量聚集，管腔明顯狹窄。瑞舒伐他汀干預(yù)組斑塊厚度減輕，泡沫細(xì)胞減少，管腔狹窄減輕，見圖1。

2.2主動(dòng)脈壁SR-AⅠ蛋白和mRNA表達(dá) 瑞舒伐他汀組主動(dòng)脈SR-AⅠ蛋白表達(dá)量輝度值（值越低表達(dá)水平越高）為（130.3±6.7），與正常對(duì)照組的（122.4±12.5）相比P>0.05，但高于高脂模型組的（88.8±2.4），P<0.05。瑞舒伐他汀組主動(dòng)脈壁SR-AⅠmRNA表達(dá)量（值越高表達(dá)水平越高）為（95.6±5.8），低于正常對(duì)照組的（99.2±4.6），P>0.05，低于高脂模型組（195.3±7.7），P<0.05，見圖2、3。

3討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與陽性對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化形態(tài)學(xué)改變較陽性對(duì)照組明顯減輕，說明瑞舒伐他汀鈣可產(chǎn)生抗AS作用， 減少動(dòng)脈粥樣斑塊形成。陽性對(duì)照組動(dòng)脈SR-AⅠ的表達(dá)均明顯高于陰性對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 提示SR-AⅠ表達(dá)在AS的發(fā)病過程中起著重要的作用。瑞舒伐他汀鈣干預(yù)組與陽性對(duì)照組相比SR-AI的表達(dá)明顯減少， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證明SR-AI表達(dá)在AS的發(fā)病過程中起著重要的作用。

研究表明，清道夫受體（Scavenger Receptor， SR） 是一種跨膜糖蛋白，可與多種帶負(fù)電荷的大分子如ox-LDL結(jié)合，并迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)降解，致使膽固醇及膽固醇酯在細(xì)胞內(nèi)聚集，形成泡沫細(xì)胞，因而SR在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起著重要的作用[2]。在巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和肝細(xì)胞都有SR 表達(dá)?，F(xiàn)階段已明確的能在AS病變部位檢測(cè)到，在泡沫細(xì)胞的形成中發(fā)揮作用的SR包括：SR-A、CD36、SR-BⅠ（SR-B）、CD68（SR-D）、LOX-1（SR-E）、SREC（SR-F）及SR-PSOX（SR-G）。其中SR的A型（SR-AⅠ、SR-AⅡ）和B型（SR-BⅠ、CD36）與AS密切相關(guān)。SR-A以三聚體形式存在。它存在3種異構(gòu)體，即SR-AⅠ、SR-AⅡ和SR-AⅢ。Ⅰ型與Ⅱ型SR-A可與OX-LDL結(jié)合，在泡沫細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起重要的作用[3]。Babaev VR等[4]用SR-AⅠ/Ⅱ基因缺陷小鼠模型研究表明，敲除SR-AⅠ/Ⅱ基因的小鼠和未敲除的小鼠相比主動(dòng)脈粥樣病變的面積減少60%，從而證明SR-AⅠ/Ⅱ明顯有助于動(dòng)脈粥樣硬化的形成。Hiltunen TP[5]研究表明WHHL （watanabe heritable hyperlipidemic rabbits ）兔的脂質(zhì)條紋里有大量的SR-AⅠ表達(dá)。Nakagawa- Toyama Y 等[6]通過人類的尸體解剖研究揭示從彌漫性內(nèi)膜增厚到動(dòng)脈粥樣斑塊的區(qū)域都有SR-AⅠ/Ⅱ的表達(dá)。本研究表明高脂模型組主動(dòng)脈SR-AⅠ表達(dá)和陰性對(duì)照組相比明顯增加，這和上述的研究是相符的。

研究表明，他汀類藥物可以通過降低LDL以及某些降脂外的作用而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)中瑞舒伐他汀組和高脂模型組相比主動(dòng)脈粥樣硬化病變減輕，表明瑞舒伐他汀有肯定的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。，和高脂模型組相比，瑞舒伐他汀組主動(dòng)脈組織SR-AⅠ下調(diào)，提示我們?nèi)鹗娣ニ∫种浦鲃?dòng)脈SR-AⅠ的表達(dá)可能為其調(diào)脂外的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制之一，但具體機(jī)制尚不明確，需完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/張燕