絲素蛋白/鈣磷復(fù)合基因支架的制備及表征

摘要：目的 人工合成的骨替代材料在治療部分類型的骨缺損時(shí)往往存在療效的不確定性，特別是在大范圍的骨缺損的修復(fù)中存在較高的失敗率，因此需迫切尋找新的解決途徑。絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，具有良好的生物學(xué)性能，本研究擬改善絲素蛋白的骨誘導(dǎo)性能。方法 采用共沉積法制備了絲素蛋白/鈣磷復(fù)合材料，制備腺病毒Ad-BMP-2，然后制備絲素蛋白/鈣磷復(fù)合基因支架。將骨間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于其上，并采用掃描電鏡（SEM）觀察細(xì)胞的貼附，及檢測(cè)細(xì)胞增殖、分化的性能進(jìn)行觀察。結(jié)果 SEM觀察顯示生物材料具有良好的孔徑；制備了Ad-BMP2腺病毒，病毒表達(dá)GFP綠色熒光蛋白；細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該生物支架生物相容性好，細(xì)胞呈梭形，舒展充分，細(xì)胞核處隆起，細(xì)胞周圍可見(jiàn)基質(zhì)附著。結(jié)論 該生物材料具有良好的孔徑及生物相容性，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：絲素蛋白；鈣磷復(fù)合材料；BMP-2；腺病毒

生物醫(yī)學(xué)組織工程是近年來(lái)繼基因工程之后取得重大技術(shù)突破的生命科學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。組織工程的三大要素是：具有增殖分化潛能的種子細(xì)胞、生物支架材料、生長(zhǎng)因子。組織工程核心技術(shù)在于構(gòu)建細(xì)胞與生物材料復(fù)合物。細(xì)胞外基質(zhì)是構(gòu)建組織工程化牙周組織的物質(zhì)基礎(chǔ)，細(xì)胞在三維支架材料中不斷生長(zhǎng)、增殖，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)取代逐漸降解的生物材料，最終形成具有活力的組織。本研究將絲素蛋白與磷酸鈣粉末混合，可使無(wú)機(jī)粉末均勻分布于絲素蛋白中，避免了無(wú)機(jī)粉末由于靜電作用互相聚集的傾向，利用仿生共沉積的方法獲得絲素蛋白磷酸鈣復(fù)合物，并結(jié)合BMP-2腺病毒，制備出絲素蛋白/鈣磷復(fù)合基因支架。

1 資料與方法

1.1絲素蛋白的制備 絲素蛋白的制備：①家蠶生絲脫膠 家蠶生絲置于約0.5‰的無(wú)水碳酸鈉溶液中，于90℃～100℃處理30min，重復(fù)3次，以脫去蠶絲中的絲膠。脫膠后洗凈，烘箱60℃烘干后得到精煉蠶絲；②絲素纖維溶解：配置CaCl2·CH3CH2OH·H2O（摩爾比1：2：8）三元溶液。于（70±2）℃在三元溶液中攪拌溶解拉松的家蠶精煉絲纖維，浴比1：10，時(shí)間1h，得到混合溶液；③透析將絲素溶液裝入透析袋，在流動(dòng)自來(lái)水中透析48h之后換用去離子水，換1次/h水，持續(xù)48h。經(jīng)透析得到純家蠶絲素蛋白溶液，溶液經(jīng)紗布過(guò)濾裝入試劑瓶中保存于冰箱備用；④家蠶絲素蛋白溶液的濃縮：將純家蠶絲素蛋白溶液倒入玻璃表面皿，于45℃攪拌，用電扇吹加速其水分的蒸發(fā)，濃縮過(guò)程持續(xù)24h。蒸發(fā)濃縮過(guò)程中防止表面結(jié)膜和表面起泡沫。

1.2磷酸鈣/絲素蛋白復(fù)合物的制備 將0.588g CaCl2·2H2O溶解于40ml乙醇中，得到入氯化鈣乙醇溶液；將0.374 g of NaH2PO4·2H2O、2g絲素蛋白溶液溶解于24L去離子水中；逐步滴加氯化鈣乙醇溶解液，并在滴加過(guò)程中攪拌，之后靜置18～48h，得到沉淀的混合物。

將所得的沉淀物去離子水過(guò)濾漂洗3次，乙醇漂洗后一次后40℃真空干燥，得到磷酸鈣絲素混合粉末。將混合物加入5%的絲素蛋白溶液中并攪拌，獲得終濃度為5%的溶液。所得溶液4℃保持0～90min，-20℃～-80℃之間過(guò)夜后真空冷凍干燥，所得的復(fù)合多孔支架材料經(jīng)過(guò)30%～100%的乙醇容易處理。

1.3質(zhì)粒提取及病毒的合成 真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.0-BMP-2由本人構(gòu)建并保存[1]，首先制備腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建pAdTrackCMV-BMP-2， 并制備包含pAdEasy I 質(zhì)粒的BJ5I83電穿孔感受態(tài)菌，得到pAd-BMP-2。

制備重組腺病毒Ad-BMP-2：取10μg pAd-BMP-2病毒質(zhì)粒及陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pAdEasyI用Pac I 37℃酶切，線性化并回收。將上述pAd-BMP-2質(zhì)粒用PacI酶切回收后取5μg線性化質(zhì)粒，稀釋入無(wú)血清培養(yǎng)液中，同時(shí)將10μl lipofectamine2000稀釋入無(wú)血清培養(yǎng)液中，室溫放置5min。將稀釋的腺病毒DNA和lipofectamine2000混合后室溫放置20min。吸出原先含血清的培養(yǎng)液，加入含DNA-lipofectamine復(fù)合體的無(wú)血清培養(yǎng)液，24h后更換含10%小牛血清的新鮮培液，1d后開(kāi)始定時(shí)觀察細(xì)胞毒效應(yīng)。24～48h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)以確定轉(zhuǎn)染及病毒包裝成功。7～10d后可觀察細(xì)胞病理變化出現(xiàn)，同時(shí)表達(dá)EGFP的細(xì)胞數(shù)逐漸增多，此時(shí)收集293細(xì)胞于液氮和37℃水浴中反復(fù)凍融4次，離心取上清的1/2重新感染HEK293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，5d后收集細(xì)胞，1500 r.p.m離心7 min小心棄上清以2ml PBS重懸，反復(fù)凍融4次，重復(fù)感染、收集步驟，如此反復(fù)進(jìn)行5次后制備高滴度腺病毒。收集第5代病毒進(jìn)行滴度（pfu/L）測(cè)定。

1.4絲素蛋白/鈣磷復(fù)合基因支架的制備及細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 將絲素蛋白/鈣磷復(fù)合材料置于在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，將病毒液滴于支架上，使之浸潤(rùn)，1ml 的腺病毒溶液滴到1mg 的干燥的絲素蛋白/鈣磷復(fù)合材料支架上，4℃ 過(guò)夜使支架與質(zhì)?；蛳俨《境浞纸Y(jié)合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機(jī)干燥。

將骨間充質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）接種于絲素蛋白/鈣磷復(fù)合基因支架上，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，并在第5d進(jìn)行電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1本方法制得的磷酸鈣與絲素蛋白具有改善的交界；復(fù)合支架材料外部、內(nèi)部孔徑孔隙率一致，孔分布均勻； 制備的支架底部無(wú)明顯的磷酸鈣聚集。圖1顯示本方法所獲的磷酸鈣絲素蛋白復(fù)合多孔支架，磷酸鈣在絲素蛋白中分布均勻，支架孔隙連通率高。

圖1 復(fù)合支架的掃描電鏡圖片，磷酸鈣與絲素蛋白具有改善的交界；復(fù)合支架材料外部、內(nèi)部孔徑孔隙率一致，孔分布均勻； 制備的支架底部無(wú)明顯的磷酸鈣聚集。

2.2 pAd-PDGFB質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切線性化后在lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，1d后熒光顯微鏡下見(jiàn)約10%的細(xì)胞表達(dá)EGFP（圖2，圖3），以后逐天增加，3d后可見(jiàn)大量細(xì)胞均表達(dá)EGFP（圖4，圖5），當(dāng)?shù)?d細(xì)胞開(kāi)始大量脫落并呈串狀時(shí)收集細(xì)胞。正常對(duì)照細(xì)胞則無(wú)此變化。將病毒滴度調(diào)整為2×1010 particles/ml.（表達(dá)形成單位/ml）。

2.3將細(xì)胞接種于復(fù)合基因支架，生物相容性好，所獲的復(fù)合支架材料由于表達(dá)BMP-2因此理論上具有骨誘導(dǎo)性，同時(shí)機(jī)械強(qiáng)度未下降。圖6顯示生物材料具有適合細(xì)胞生長(zhǎng)的孔徑，細(xì)胞伸展附著較好。

3 討論

外源性生長(zhǎng)因子的引入可促進(jìn)骨再生，然而外源性生長(zhǎng)因子半衰期較短，要求相對(duì)大的劑量才能刺激足量的組織形成而發(fā)揮治療作用，增加了臨床應(yīng)用成本并可能導(dǎo)致毒性作用的產(chǎn)生，同時(shí)應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子還存在需反復(fù)給藥、易流失和效率低等缺點(diǎn)。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子內(nèi)源化的方法已逐漸成熟。將有治療作用的基因通過(guò)一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞，以維持較高的生長(zhǎng)因子濃度，促進(jìn)組織愈合及再生。這樣就避免了應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子蛋白所帶來(lái)的弊病，在骨再生及組織工程中有廣闊的應(yīng)用前景?；騻鬟f系統(tǒng)的載體分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)[2]。非病毒載體主要為質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物、分子耦聯(lián)載體等，其具有毒性及免疫反應(yīng)低，穩(wěn)定，抗原性小，質(zhì)粒DNA易于獲取容易，但其基因轉(zhuǎn)移率低，而且不能長(zhǎng)期表達(dá)，組織的特異性不高，需要大量、持續(xù)、反復(fù)使用，且基因表達(dá)時(shí)間短。常見(jiàn)的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、慢病毒、人細(xì)胞巨化病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒在及腺病毒相關(guān)病毒rAAV體內(nèi)呈損失性感染，其免疫反應(yīng)低。Sugiyama等學(xué)者用用慢病毒介導(dǎo)BMP-2先體外后體內(nèi)基因觀察肌肉內(nèi)成骨，發(fā)現(xiàn)BMP-2促進(jìn)骨再生，植入8w后BMP-2仍然持續(xù)表達(dá)，顯示了慢病毒在骨再生治療中的前景[3]。腺病毒是最常用于骨缺損修復(fù)的基因載體[4]，它可插入7.5kb的外源基因，且相對(duì)穩(wěn)定，能純化和濃縮，它存在以下優(yōu)點(diǎn)：可感染分裂及非分裂期的細(xì)胞；腺病毒載體無(wú)需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，目的基因在宿主細(xì)胞基因組外游離狀態(tài)下表達(dá)，整合突變致癌可能性小，基因毒性低。重組腺病毒構(gòu)建較早使用的是雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法，將目的基因亞克隆至穿梭質(zhì)粒中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，再與腺病毒基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，兩質(zhì)粒借所帶的部分同源序列在293細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組而形成重組體，并進(jìn)一步包裝成重組腺病毒顆粒。因?yàn)樵摲N制備方法要求兩種質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染及同源重組必須同時(shí)發(fā)生在293細(xì)胞內(nèi)，才有可能形成重組體并包裝成病毒，由于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染效率較低，同源重組效率更低。目前較多使用的為AdEasy系統(tǒng)[5]，其腺病毒質(zhì)粒同源重組在大腸桿菌中高效進(jìn)行，且細(xì)菌繁殖快，同源重組能力強(qiáng)，因而從根本上克服細(xì)胞內(nèi)同源重組率低的缺陷。同時(shí)由于在腺病毒骨架中含有的EGFP報(bào)告基因，便于監(jiān)測(cè)病毒是否包裝成功，大大減少了病毒的制備時(shí)間。

有學(xué)者利用飽和磷酸鈣在仿生液中的析出特性，將生長(zhǎng)因子與磷酸鈣沉積于種植體表面，形成一層三維的晶格，生長(zhǎng)因子在第五周仍然緩慢釋放，促進(jìn)了骨的愈合，顯示了生長(zhǎng)因子通過(guò)共沉積達(dá)到緩釋的潛質(zhì)[6]。然而，該沉積方法獲得的支架的三維孔狀結(jié)構(gòu)及表面孔隙不可避免的部分喪失[6，7]。也有學(xué)者通過(guò)熔鹽浸取法獲得的CaP復(fù)合支架，然而存在機(jī)械強(qiáng)度不足的缺點(diǎn)[8]。電沉積法可通過(guò)改變電壓電流獲得良好的表面形貌和化學(xué)成分[9]，然而在最佳點(diǎn)沉積條件下的PH值和溫度均不會(huì)破壞生長(zhǎng)因子的活性。絲素蛋白由于良好的機(jī)械性能及生物相容性及可降解性[10-11]作為組織工程材料已廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將絲素蛋白與磷酸鈣粉末混合，可使無(wú)機(jī)粉末均勻分布于絲素蛋白中，避免無(wú)機(jī)粉末由于靜電作用互相聚集的傾向。利用仿生共沉積的方法獲得絲素蛋白磷酸鈣復(fù)合物，再與組織工程支架結(jié)合，有望獲得均勻孔徑的三維支架，隨著絲素蛋白與多孔生物陶瓷支架結(jié)合，可改進(jìn)其機(jī)械性能，同時(shí)生長(zhǎng)因子隨著磷酸鈣的溶解而釋放而達(dá)到緩釋的目的。

本方法所獲的磷酸鈣絲素蛋白復(fù)合多孔支架細(xì)胞生物相容性好，制作過(guò)程無(wú)需添加有毒的化學(xué)偶聯(lián)劑，工藝流程簡(jiǎn)單； 磷酸鈣與絲素蛋白具有改善的交界； 磷酸鈣在絲素蛋白中分布均勻，支架孔隙連通率高。復(fù)合支架材料外部、內(nèi)部孔徑孔隙率一致，孔分布均勻； 制備的支架底部無(wú)明顯的磷酸鈣聚集。所獲的復(fù)合支架材料具有骨誘導(dǎo)性，同時(shí)機(jī)械強(qiáng)度未下降。生物材料具有適合細(xì)胞生長(zhǎng)的孔徑，同時(shí)緩釋BMP-2基因，可應(yīng)用于組織工程支架領(lǐng)域，以替代自體骨移植等，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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編輯/哈濤