毒胡蘿卜素誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細胞凋亡的實驗研究

摘要：目的 初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素（TG）對肺泡巨噬細胞（AM）增殖和凋亡的影響。方法 分離純化AM并體外培養(yǎng)， 經(jīng)不同濃度的TG（1μM，2μM，4μM，8μM）干預(yù)24h后，MTT檢測細胞存活率，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況并在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)。結(jié)果 與對照組比較，經(jīng)過TG干預(yù)24h后的細胞存活率下降，凋亡率增高且具有濃度依賴性，P<0.05。結(jié)論 毒胡蘿卜素具有抑制AM增殖，誘導(dǎo)AM凋亡的作用。

關(guān)鍵詞：毒胡蘿卜素；肺泡巨噬細胞；凋亡；肺纖維化

肺纖維化的病因很多，但是不同病種的肺間質(zhì)纖維化改變都是從肺泡炎開始，在發(fā)展和修復(fù)的過程中逐步導(dǎo)致肺纖維化的傾向，到了晚期大多認為纖維化是不可逆的，治療難度較大。其實在早期大部分是肺泡炎和部分纖維化并存，其肺泡炎是完全可以逆轉(zhuǎn)的，因此在病情發(fā)展的早期，爭取可逆部份和時間，控制病情發(fā)展顯得尤為重要。肺泡巨噬細胞（AM）是參與肺部炎癥的主要免疫細胞，也是氣道局部炎癥反應(yīng)的主要始動細胞[1]。活化的肺泡巨噬細胞釋放的細胞因子和炎性遞質(zhì)在早期肺損傷中起重要作用[2]，在肺纖維化的發(fā)展過程中，AM被激活并大量的增殖，促進了肺間質(zhì)炎癥的發(fā)展，從而最終形成肺間質(zhì)的纖維化。

有研究結(jié)果顯示細胞凋亡在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是新近研究發(fā)現(xiàn)的除線粒體凋亡通路和死亡受體通路兩大經(jīng)典細胞凋亡途徑之外的又一細胞凋亡途徑[3]。本研究對大鼠肺泡巨噬細胞進行體外培養(yǎng)，并觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素（TG）對AM增殖和凋亡的影響，初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對AM凋亡的影響.

1資料與方法

1.1一般資料 SD大鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，毒胡蘿卜素TG購自Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，MTT試劑盒購自南京凱基生物公司， AnnexinⅤ-FITC/PI測凋亡試劑盒購自BestBio公司。

1.2方法

1.2.1大鼠AM的分離純化 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定于手術(shù)板上，常規(guī)消毒分離氣管，用小手術(shù)剪剪一V型切口，經(jīng)氣管插管用37℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗4～5次，5ml/次，回收液集中于無菌試管中，經(jīng)雙層紗布過濾后移至無菌離心管中，離心（4 ℃，1500 r/min×10 min），PBS液漂洗沉淀后，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml重懸沉淀，接種于培養(yǎng)皿中。經(jīng)37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。棄培養(yǎng)液，用PBS洗去除未貼壁細胞，貼壁細胞則為純化AM[4]。

1.2.2 MTT法測細胞存活率 在96孔板內(nèi)加入200μL的細胞懸液，調(diào)整每孔細胞數(shù)為4000，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，棄上清，每組加入含有不同濃度TG（1μM，2μM，4μM，8 μM）的等體積培養(yǎng)液200μL，對照組加入等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復(fù)孔。在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加50μL 1×MTT。4h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150μL的DMSO，充分混勻，使結(jié)晶充分溶解，酶標儀在490nm 波長處檢測每孔的光密度OD 值，實驗重復(fù)3 次。計算細胞存活率，細胞存活率% =（TG 干預(yù)組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況 在六孔板內(nèi)加入細胞懸液，調(diào)整濃度至1×106/ml，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h貼壁后，每組分別加入不同濃度的TG（1μM，2μM，4μM，8μM） 對照組加入等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，終止培養(yǎng)。收集上清和胰酶消化下來的貼壁細胞，2 000 r/min，5min離心后制成單細胞懸液，冷PBS洗滌細胞兩次。然后加入400μL1×Binding Buffer重懸細胞沉淀并移入流式管內(nèi)，先加入5μL AnnexinV-F1TC染色液，輕輕混勻后于2℃～8℃避光條件下孵育15 min，再加入10μL PI染液，同等條件下孵育5min，在波長488 nm下，1 h內(nèi)上機檢測細胞凋亡，并用WinMDI 2.9分析軟件行凋亡率測定，實驗重復(fù)3次.

1.2.4熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài) 滴一滴經(jīng)過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染（操作步驟同上）的細胞懸液于載玻片上，用蓋玻片蓋上。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察，Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

2結(jié)果

2.1 TG對肺泡巨噬細胞存活率的影響 與對照組比較，不同濃度的TG（1μM，2μM，4μM，8μM）作用于AM24h后，細胞存活率明顯下降，（#P<0.05），并具有濃度依賴性（見圖1） 。

2.2 TG對肺泡巨噬細胞凋亡率的影響 經(jīng)過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染的細胞，在流式細胞儀檢測細胞的凋亡，分布于流式細胞圖左下象限（LL）的是正常細胞，分布于右下象限（LR）的是早期凋亡細胞，分布于右上象限（UR）的是晚期凋亡或壞死細胞。早晚期細胞凋亡百分數(shù)總和稱為總凋亡率。見圖2，細胞凋亡檢測結(jié)果顯示對照組總凋亡率（3.89+3.57）%，TG（1μM，2μM，4μM，8μM）各組總凋亡率分別為（8.01+3.61）%，（10.28+5.08）%，（14.98+4.84）%，（15.60+5.88）%，與對照組比較，均具有明顯增高，（ #P<0.05），且具有濃度依賴性。

2.3熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài) 見圖3，整個細胞呈綠色熒光的是早期凋亡細胞，細胞內(nèi)被染成紅色的是晚期凋亡細胞或壞死細胞.與對照組比較，不同TG濃度組（1μM，2μM，4μM，8μM）的細胞凋亡數(shù)量明顯增加，且各組之間也有顯著差異。

死亡受體活化和線粒體損傷是兩條經(jīng)典的介導(dǎo)細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路，除了這兩條經(jīng)典的凋亡途徑外，近來研究發(fā)現(xiàn)過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可啟動細胞凋亡，是一條新的細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路，這一信號傳導(dǎo)通路包括非折疊蛋白反應(yīng)和鈣離子起始信號等機制[5]。TG的作用位點是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Ca2+- ATP 酶抑制劑，誘導(dǎo)胞漿內(nèi)Ca2+濃度上升和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存鈣的下降從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)凋亡，而與線粒體途徑和死亡受體途徑無關(guān)，因此被廣泛認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性的誘導(dǎo)劑[6]。

近年來，有許多研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生相關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路或許可以作為治療肺纖維化的靶點，AM做為肺纖維化發(fā)病早期的炎癥始動細胞，其增殖凋亡情況關(guān)系到肺間質(zhì)纖維化病情的發(fā)展。本研究推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與AM的增殖凋亡有關(guān)，用不同濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性誘導(dǎo)劑TG作用于AM，通過檢測TG對AM存活率和凋亡情況的影響，初步驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否介導(dǎo)MA的凋亡。結(jié)果顯示，隨著TG 濃度的增加，AM的存活率逐漸降低，明顯低于對照組，流式細胞儀檢測，隨著TG 濃度的增加，AM的凋亡率逐漸增高，明顯高于對照組，在熒光顯微鏡下觀察有典型的細胞凋亡形態(tài)改變。提示TG具有抑制AM增殖，誘導(dǎo)AM凋亡的作用，初步分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與AM增殖凋亡的相關(guān)關(guān)系，為治療肺纖維化提供新的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻：

[1]Lentsch A B，Czermak B J ，Bless N M，et al. Essential role of alveolar macrophages in intrapulmonary activation of NF-kappaB [J].Am J Respir Cell Mol Biol， 1999：20 （4） ： 692-698.

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[6]何白梅，羅百靈，袁浩.毒胡蘿卜素誘導(dǎo)A549 細胞凋亡的實驗研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2010，10（1）：23-25.

編輯/許言