TLR4抗體對(duì)Aβ1—42誘導(dǎo)AD小鼠模型神經(jīng)功能作用

摘要：目的 探討TLR4抗體對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能的影響。方法 采用雙側(cè)海馬注射Aβ1-42的方法制備小鼠AD模型，以C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為四組，AD組，抑制劑組，AD+抑制劑組，生理鹽水組，水迷宮實(shí)驗(yàn)觀測小鼠行為學(xué)改變。結(jié)果 AD組模型與生理鹽水組比較，其潛伏期延長，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，游泳距離、內(nèi)環(huán)時(shí)間及內(nèi)環(huán)距離延長，游泳速度減慢。AD+抑制劑組與AD組比較，其潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)相對(duì)增多，游泳距離、內(nèi)環(huán)時(shí)間及內(nèi)環(huán)距離縮短。生理鹽水組及抑制劑組屬于對(duì)照組，這兩組之間無顯著差異。結(jié)論 給予TLR4抗體可以改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

關(guān)鍵詞：TLR4；阿爾茨海默病；Aβ1-42

阿爾茨海默病是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，早期表現(xiàn)為記憶力減退和生活自理能力下降，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙缺失，精神行為異常及生活自理能力完全消失[1]。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，其中腦內(nèi)慢性炎癥改變作為病因之一越來越受到重視。Toll樣受體4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為炎癥改變重要通路之一，抑制這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是否可以改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，本文通過制作小鼠模型來探討這一問題。

1資料與方法

1.1試劑與儀器 Aβ1-42（貨號(hào)A9180）；MAb-mTLR4/MD2（貨號(hào)30-01-mt4m）；腦立體定位儀；泰盟Morris水迷宮。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用周齡為12～16w，體重25～30g的健康雌性C57BL/6J小鼠48只，將小鼠完全隨機(jī)分為AD組，AD+抑制劑組，生理鹽水組，抑制劑組，每組12只。

1.3模型制備 ①AD模型制備：將小鼠按0.004ml/g體重的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上。常規(guī)備皮消毒，頭頂部正中切開，暴露前囟，參照小鼠腦立體定位儀，每只小鼠雙側(cè)海馬各注射1μlAβ1-42（濃度為5μg/μl）；坐標(biāo)為前囟后2.2mm，矢狀縫雙側(cè)旁開1.5mm，既為海馬的體表部位，進(jìn)針深度即為顱骨表面向下1.5mm，注射時(shí)速度為1μl/min，注射后留針8min，拔針時(shí)速度為1mm/min，拔出針頭后暫不縫合，用無菌生理鹽水紗布覆蓋顱骨表面，使其保持濕潤，40min后，用同樣的方法，在同一部位注射等體積的生理鹽水雙側(cè)各1μl，在留針8min后，按照同樣的出針?biāo)俣劝纬鲠橆^，給與消毒縫合，白熾燈光照射，促進(jìn)清醒及保溫，然后單籠飼養(yǎng)，防止小鼠之間互相咬傷。②生理鹽水組模型制備：注射部位、方法同①，先注射等體積的無菌生理鹽水各1μl，40min后再次在同部位注射等體積生理鹽水1μl。③AD+抑制劑組模型制備：按照①的方法將1μlAβ1-42（濃度為5μg/μl）注射至小鼠兩側(cè)海馬，注射部位及方法相同，留針8min后，按1mm/min出針，40min后，用同樣的方法，在同一部位注射等體積的MAb-mTLR4/MD2雙側(cè)各1μl（濃度為1μg/μl）。④抑制劑組模型制備：注射部位、方法同①，先雙側(cè)海馬注射濃度為1μg/μl的MAb-mTLR4/MD2各1μl，40min后在同部位注射生理鹽水各1μl。

1.4學(xué)習(xí)記憶能力檢測 術(shù)前給予3d行為學(xué)測試，讓小鼠在水迷宮中自由游泳以熟悉環(huán)境，上下午各 1 次，每次時(shí)間為 60s，如果 60s 內(nèi)找不到平臺(tái)，由試驗(yàn)者將小鼠放到平臺(tái)上10s 以熟悉環(huán)境。正式試驗(yàn)過程中，小鼠如果在60s 內(nèi)找不到平臺(tái)也將其放在平臺(tái)上 10s并將潛伏期記為 60s，術(shù)后第8d開始正式測評(píng)，連續(xù)測評(píng)3d，上下午各一次，第3d下午定航實(shí)驗(yàn)完畢后，撤掉平臺(tái)，選取遠(yuǎn)離目標(biāo)象限的第一象限為入水點(diǎn)，游泳時(shí)間為 60s記錄小鼠在原平臺(tái)處停留時(shí)間以及穿越次數(shù)，此為空間搜索實(shí)驗(yàn)。

1.5統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析 將第3d的平均成績作為本次試驗(yàn)的結(jié)果用于分析比較，使用SPSS16.0 軟件，數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單個(gè)重復(fù)測量因素方差分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

水迷宮檢測：①AD組vs AD+抑制劑組，AD組vs生理鹽水組的3d潛伏期時(shí)間（s）、內(nèi)環(huán)時(shí)間（s）的時(shí)間延長，內(nèi)環(huán)距離（cm）增加及穿越平臺(tái)次數(shù)減少，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；生理鹽水組vs抑制劑組之間無明顯差別，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②AD組vs生理鹽水組的3d游泳速度（cm/s）的速度減慢，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；AD組vsAD+抑制劑組比較P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)差異；生理鹽水組vs抑制劑組比較P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3討論

AD發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為其是多種發(fā)病因素共同參與的異質(zhì)性疾病，主要涉及Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥反應(yīng)等機(jī)制[2]。其中，炎性反應(yīng)是AD核心病理機(jī)制，炎癥介質(zhì)促進(jìn)AD的發(fā)生與發(fā)展。

TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接參與免疫炎癥反應(yīng)的激活和調(diào)控，TLR4調(diào)控炎癥反應(yīng)主要有兩個(gè)通路，MyD88-依賴性通路及TRIF-依賴性通路。有研究表明AD 腦中TLR4 表達(dá)增多[3]，TLR4以 LPS為配體，激活小膠質(zhì)細(xì)胞后可通過增加細(xì)胞過氧化負(fù)荷，上調(diào)炎癥因子及增加Aβ蛋白沉積，促發(fā)AD 的發(fā)生；TLR4相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路也參與了Aβ1-42蛋白沉積后對(duì)神經(jīng)元的毒性作用。如外源性Aβ1-42蛋白能與 TLR4發(fā)生相互作用，激活該信號(hào)通路進(jìn)一步促發(fā)上述炎癥因子，尤其是 TNFA的產(chǎn)生。而且這種作用可以被特異性的抗 TLR4抗體所部分阻斷。在 TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被TLR4 抗體阻斷后，NF‐κB p65 表達(dá)、 TNFα分泌水平明顯下降[4，5]。這些實(shí)驗(yàn)提示TLR4調(diào)節(jié)的信號(hào)通路參與了AD的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Aβ1-42雙側(cè)海馬注射制備小鼠AD模型，并給與海馬內(nèi)注射TLR4抗體，以觀察阻斷TLR4調(diào)節(jié)的信號(hào)通路對(duì)小鼠AD模型學(xué)習(xí)記憶功能的影響。結(jié)果顯示：AD組模型與生理鹽水組比較，其潛伏期延長，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，游泳距離、內(nèi)環(huán)時(shí)間及內(nèi)環(huán)距離延長，游泳速度減慢。AD+抑制劑組與AD組比較，其潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)相對(duì)增多，游泳距離、內(nèi)環(huán)時(shí)間及內(nèi)環(huán)距離縮短。由于注射TLR4的抗體，阻斷TLR4介導(dǎo)的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而減輕AD的癥狀，使其與AD組比較，在記憶功能方面略有改善。生理鹽水組及抑制劑組屬于對(duì)照組，這兩組之間無顯著差異，說明TLR4抑制劑對(duì)小鼠無神經(jīng)毒性，不干擾AD模型的制作。

綜上所述，通過給予AD小鼠注射TLR4抗體，從行為學(xué)上可以改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，在今后的實(shí)驗(yàn)中，我們將應(yīng)用western Blot、EMSA等方法對(duì)TLR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AD的病理生理過程中的作用及機(jī)制進(jìn)行研究，如測定MyD88依賴性通路和TRIF依賴性通路中蛋白激酶的表達(dá)及NFκB和IRF-3的活性等。

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編輯/申磊