Th17在RSV感染嬰幼兒的表達(dá)上調(diào)及其可能的臨床意義

摘要：目的 初步探討外周血Th17細(xì)胞亞群水平與嬰幼兒呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）感染的關(guān)系，為深入研究嬰幼兒呼吸道病毒感染的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法 采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）， 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分別檢測經(jīng)佛波酯（PMA）和離子霉素（Ionomycin）刺激后的成人組（n=8），健康新生兒組（n=7），患病新生兒兒組（n=5）外周血中CD4+T細(xì)胞中IL-17的生成情況。結(jié)果 新生兒外周血中CD4+IL-17+細(xì)胞（即Th17細(xì)胞）數(shù)量相較成人少很多。但是相比同齡對照組，RSV感染新生兒外周血中Th17細(xì)胞亞群的表達(dá)卻有明顯增加。結(jié)論 RSV感染新生兒外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá)水平升高，提示IL-17和Th17細(xì)胞亞群的上升表達(dá)可能與新生兒呼吸道病毒感染有一定的關(guān)系，為嬰幼兒呼吸道病毒感染的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供了一個新的方向。

關(guān)鍵詞：嬰幼兒；呼吸道感染；Th17；RSV

呼吸道合胞體病毒感染（RSV ）是在全球?qū)儆谝潞粑栏腥镜某Ｒ娖鹨颍质菋胗變汉粑栏腥咀畛Ｒ姷牟≡?，這也是引致1歲以下嬰兒肺部受感染的最普遍原因，能引起呼吸道疾病，通常伴隨著炎性細(xì)胞快速浸潤，過多黏液產(chǎn)生和延遲的CD8T細(xì)胞效應(yīng)[1，2]。白細(xì)胞介素（IL-17）是新發(fā)現(xiàn)的前促炎性細(xì)胞因子，主要來源于Th17細(xì)胞亞群，而Th17細(xì)胞由CD4+初始T細(xì)胞分化而來。近來的研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在人和鼠呼吸道病毒感染疾病均發(fā)揮免疫效應(yīng)[3，4]。由于人的免疫系統(tǒng)在出生的第1個月內(nèi)迅速發(fā)展，出生1個月后的嬰兒外周血Th17細(xì)胞亞群的水平可能不同于臍帶血。據(jù)此我們推測，病毒感染嬰兒體內(nèi)Th17細(xì)胞亞群的生成會增加。因此，本次實驗采用流式細(xì)胞術(shù)研究了成人、健康嬰兒和RSV感染嬰兒外周血CD4+初始T細(xì)胞IL-17的表達(dá)水平變化即Th17細(xì)胞亞群的生成情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 正常成人，正常新生兒與患病新生兒外周血由湖南省婦幼保健院提供。

1.2主要試劑及儀器 佛波酯（PMA），離子霉素（Ionomycin），高爾基抑制劑（GolgiStop）均購自Sigma公司?？谷薈D3APC抗體、抗人CD8α FITC抗體、PE標(biāo)記的抗人IL-17mAb，，同型對照購自eBioscience公司。人淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶公司。RPMIl640細(xì)胞培養(yǎng)基來源于美國Gbico公司。流式細(xì)胞儀BD FACSCanto II，美國BD公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1 PBMCs的分離培養(yǎng)及刺激、流式檢測 用肝素鈉抗凝的無菌真空管采集所有入選對象外周血3ml，樣本于4h內(nèi)處理。采用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，以RPMIl640培養(yǎng)液重懸，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整密度為2×106個/ml。加入終濃度5ng/ml PMA，1 μg/ml離子霉素，充分混勻。置37℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)1 h，加入終濃度0.66 μg/ml GolgiStop培養(yǎng)4h。用含2%胎牛血清的PBS洗滌2次，細(xì)胞染色，4℃，30min ，流式細(xì)胞儀檢測CD4+IL-17+細(xì)胞（即Th17細(xì)胞）。

1.3.2統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS l5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異比較采用方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測5例RSV感染新生兒、7例健康新生兒和8例成人外周血中CD4+T細(xì)胞IL-17的生成情況（見圖1）。無論是健康還是患病新生兒，其外周血中CD4+T細(xì)胞IL-17的生成水平均顯著低于成人（P<0.01）。相較而言，健康新生兒外周血中Th17細(xì)胞幾乎可以忽略，但Th17 細(xì)胞存在于RSV感染新生兒外周血中并且明顯升高（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

呼吸道合胞病毒（RSV）是引起小兒病毒性肺炎最常見的病原，可引起間質(zhì)性肺炎，及毛細(xì)支氣管炎。近10年來合胞病毒肺炎及毛細(xì)支氣管炎占我國嬰幼兒病毒性肺炎第1位。這種感染可能是致命的，它將威脅到那些太小的嬰兒和有高風(fēng)險病情的孩子，比如先天性心臟病。

Th17細(xì)胞是一個新發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞亞群，其功能與表型不同于Th1和Th2， 主要效應(yīng)因子是IL-17[5]。初始CD4+T細(xì)胞在TGF-β 和IL-6 的共同誘導(dǎo)下分化為Th17，分泌IL-6和IL-17，在炎癥反應(yīng)過程發(fā)揮重要作用，與肺部感染、哮喘、腸道炎癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病密切相關(guān)[6，7]。IL-17是一種具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的前促炎性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞釋放多種炎性因子，也可以促使氣道黏液腺分泌大量黏液，與氣道慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。通常情況下，Th17細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，為了證明嬰幼兒RSV感染和Th17細(xì)胞水平升高有關(guān)，我們采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了經(jīng)PMA和離子霉素刺激后的RSV感染新生兒、健康新生兒和成人外周血中CD4+T細(xì)胞IL-17的生成水平即Th17細(xì)胞的產(chǎn)生情況。結(jié)果證明，由于剛出生不久的嬰幼兒免疫系統(tǒng)還不完善，其外周血中Th17細(xì)胞水平遠(yuǎn)低于健康成人，這些和以往的研究資料相符[8]。不同的是，相對于同齡健康組，RSV感染新生兒外周血中Th17細(xì)胞水平卻有明顯升高。因此我們可以推測，Th17細(xì)胞亞群的生成增加和嬰幼兒呼吸道病毒感染有著密切的聯(lián)系，Th17細(xì)胞和IL-17可能在嬰幼兒呼吸道病毒感染疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這為研究Th17細(xì)胞的生理和病理意義奠定了基礎(chǔ)，也有可能成為治療嬰幼兒呼吸道感染的一個新的靶點。

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編輯/哈濤