半枝蓮多糖對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制作用和Bcl—2蛋白表達(dá)的影響

摘要：目的 研究半枝蓮多糖對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增值抑制作用，觀察對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法 常規(guī)培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤 U251 細(xì)胞，分別用12.5、25、50、100 μg/mL半枝蓮多糖作用于U251細(xì)胞；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT 法）檢測(cè)U251細(xì)胞增殖抑制率；Western blot檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 半枝蓮多糖抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖，抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性；隨著半枝蓮多糖濃度的增加，U251中Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈減少趨勢(shì)。結(jié)論 半枝蓮多糖可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：半枝蓮多糖；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；細(xì)胞增殖；Bcl-2蛋白

半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don）為唇形科黃岑屬植物，其中SBPS是從半枝蓮中分離的主要功能性成分之一。研究證明半枝蓮多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、增效減毒、抗氧化、抗衰老等生物活性[1]。宋高臣等[2]通過SP免疫組織化學(xué)染色技術(shù)測(cè)定HepA瘤細(xì)胞中Rb、P16基因蛋白的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)表明半枝蓮多糖對(duì)HepA瘤細(xì)胞增殖的抑制作用可能通過上調(diào)抑癌基因Rb、P16的蛋白表達(dá)而達(dá)到。本研究旨在討論半枝蓮多糖是否對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有增長(zhǎng)抑制作用，并觀察對(duì)Bcl-2蛋白的表達(dá)是否有影響，為半枝蓮多糖的抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制尋找切入點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料 細(xì)胞系膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251 來自中科院上海細(xì)胞所，半枝蓮多糖購(gòu)于寧波德康生物制品有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；苯甲基硫酰氟（PMSF）為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；RPMI-1640 培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)（MTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品、小鼠抗Bcl-2單克隆抗體為Santa Cruz 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配置 常規(guī)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以DMSO溶解半枝蓮多糖，-20℃貯存，備用。配制12.5、25、50、100 μg/mL的半枝蓮多糖工作液，對(duì)照組為完全培養(yǎng)基。

1.2.2 MTT法檢測(cè)半枝蓮多糖對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率 消化 U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整至 1×105個(gè)/L，接種于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。吸去舊培養(yǎng)液，加入終濃度為0（對(duì)照組）、12.5、25、50、100 μg/mL的半枝蓮多糖工作液，培養(yǎng)24、48及72 h。加入新鮮配制的MTT，培養(yǎng)4 h，取出，棄上清，加入DMSO，于搖床振蕩10 min，顆粒完全溶解后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（A值）。每組設(shè)5個(gè)平行孔，重復(fù)測(cè)量3次。計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）= （1-B/A）×100%（A、B分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的光密度值）。

1.2.3 Western blot檢測(cè) U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞用100 μg/mL的半枝蓮多糖工作液處理48 h，收集細(xì)胞，3000 r/min 離心10 min，冰 PBS 沖洗，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解1 h，13000 r/min 離心 10 min，收集上清。應(yīng)用 Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白含量。加入上樣緩沖液后加熱，凝膠電泳。將蛋白帶轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，封閉液作用2 h。加入 p53、p21-抗，4 ℃ 過夜。加相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。以ECL 顯色系統(tǒng)顯色。分析膠片中的蛋白條帶，以各組灰度面積的乘積/內(nèi)參照（β-actin）灰度面積的乘積反映相對(duì)蛋白表達(dá)豐度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1噻唑蘭方法（MTT法）測(cè)定半枝蓮多糖對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用 半枝蓮多糖在12.5～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，均能明顯抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并隨劑量的增加抑制作用增強(qiáng)，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)，見表1、表2；抑制率，見圖1。

2.2半枝蓮多糖對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響 從抑制率來看，50、100 μg/mL的半枝蓮多糖作用較明顯，所以選擇這兩個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半枝蓮多糖可以下調(diào)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，見圖2。

3討論

在腫瘤的防治過程中，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物以及抗腫瘤輔助藥物是研究的重要方向，而中草藥在抗腫瘤方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力。半枝蓮在臨床上是一種常用的抗癌組方藥物， 常與其他中藥聯(lián)合復(fù)方治療多種腫瘤[3]，如胃癌、腸癌、肺癌、婦科惡性腫瘤，但其相關(guān)的有效成分及作用機(jī)制尚不清楚[4]。對(duì)于其藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，特別是抗癌機(jī)制的研究并不深入，僅見半枝蓮提取物能明顯抑制K562細(xì)胞的增殖[5]，半枝蓮醇提物有抗腫瘤活性[6]，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出半枝蓮多糖對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞有增值抑制作用。

細(xì)胞凋亡是正常組織細(xì)胞精細(xì)調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞的凋亡易感性受多種凋亡基因表達(dá)產(chǎn)物相互間的作用影響。bcl-2蛋白是bcl-2家族中重要的凋亡抑制基因，主要通過穩(wěn)定線粒體膜電位，阻止細(xì)胞色素C和凋亡抑制因子的釋放，阻斷Caspase酶活化的上游信號(hào)傳遞通路等作用，抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡變。

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，具有多質(zhì)性和浸潤(rùn)性的特點(diǎn)，手術(shù)時(shí)往往難以完全切除徹底，且對(duì)放療較不敏感，因此，該腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率高，治療較棘手。腦膠質(zhì)瘤日前尚缺乏有效化療藥物，患者預(yù)后較差，術(shù)后平均生存時(shí)間<2年。因此開發(fā)安全有效的藥物或?qū)ふ抑形麽t(yī)結(jié)合綜合治療方法，對(duì)于延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者生存期的延長(zhǎng)有重要意義。本研究通過Western blot檢測(cè)可以看出半枝蓮多糖可以下調(diào)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，可為中藥多糖抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制的研究提供新的方向或靶點(diǎn)，為中藥抗腫瘤的研究提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

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