p—STAT3 與HER2在乳腺癌分子亞型中表達(dá)的相關(guān)性分析

摘要：目的 探討p-STAT3（磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）及人類表皮生長因子受體-2（HER2）在乳腺癌分子亞型中的表達(dá)及其相關(guān)性。方法 根據(jù)Nielsen標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分子分型的59例乳腺癌組織切片，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測p-STAT3及HER2的表達(dá)水平。結(jié)果 在乳腺癌各分子亞型中，p-STAT3均有表達(dá)，且可觀察到p-STAT3在細(xì)胞核內(nèi)的定位。在腺腔A型、腺腔B型、HER2過表達(dá)型、基底樣型乳腺癌中，p-STAT3的表達(dá)率分別為21.42%、83.33%、83.33%、66.67%， p-STAT3與HER2在乳腺癌分子亞型中的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.452，P<0.01）。結(jié)論 p-STAT3與HER2在乳腺癌分子亞型中的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；分子分型；免疫組織化學(xué)；p-STAT3；HER2

乳腺癌是近年來發(fā)病率持續(xù)增高的女性惡性腫瘤，其高度異質(zhì)性導(dǎo)致臨床預(yù)后的多態(tài)性。近年來，不少學(xué)者根據(jù)分子基因的表達(dá)，將乳腺癌分類成不同的亞型[1]：Luminal亞型（ER/PR+）、HER2過表達(dá)型（ER-、PR-、HER2+）、Basal-like（ER-、PR-、HER2-）型和Normal-like型，并發(fā)現(xiàn)不同分子亞型乳腺癌的預(yù)后有顯著差異[2]。HER2是原癌基因CerB2編碼的具有受體酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，屬表皮生長因子受體家族，與腫瘤形成密切相關(guān)[3]，過表達(dá)HER2乳腺癌的侵襲性增強(qiáng)[4]。STAT3作為HER2的下游分子，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族（signal transducer and activator of transcription，STATs）中重要成員，已被確定為癌基因[5]，因其本身及其磷酸化形式（p-STAT3）在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中持續(xù)激活和異常表達(dá)，轉(zhuǎn)移及血管生成有關(guān)[6]，且p-STAT3可促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)，有拮抗某些化療藥物的作用，其與乳腺癌的相關(guān)性研究成為近年來惡性腫瘤信號通路研究的熱點[7]。在乳腺癌的分子亞型中，HER2的過表達(dá)是否伴隨著p-STAT3的高表達(dá)即二者的相關(guān)性研究尚無文獻(xiàn)報道，因此本實驗擬通過檢測p-STAT3在乳腺癌組織各分子亞型中的表達(dá)情況，并分析其與組織中HER2表達(dá)的相關(guān)性，探討STAT3是否可作為乳腺癌分子分型的補(bǔ)充，為乳腺癌患者的分子靶向治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年9月～2013年9月徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科有完整切片和石蠟檔案及病歷資料的浸潤性乳腺癌病例59例及乳腺纖維腺瘤病例10例，其中乳腺癌腺腔A型14例，腺腔B型15例，基底樣型13例，HER2過表達(dá)型17例。試劑：兔抗人p-STAT3抗體及兔抗人HER2抗體購自美國EPITOMICS公司。MaxVision快速法試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液等試劑購自邁新公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測p-STAT3表達(dá) p-STAT3抗體1：200濃度稀釋，室溫靜置備用。主要實驗步驟：①脫水：65°C 烤箱中干烤30 min；②脫蠟：二甲苯I中浸泡15 min，之后二甲苯II中浸泡15 min；⑴在無水乙醇I、無水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中分別浸泡各5 min；⑵雙蒸水中浸泡5 min；③微波修復(fù)抗原：將切片浸入枸櫞酸修復(fù)液，先高火2 min將沸未沸時轉(zhuǎn)至低火，持續(xù)約5 min；⑴室溫下PBS洗滌5 min×3次；⑵3%雙氧水室溫孵育5-10 min；⑶室溫下PBS洗滌5 min×3次；④封閉：滴加正常羊血清封閉液（A試劑），37°C 孵育10-15 min；⑴滴加p-STAT3一抗，37°C 2-3h，后室溫下PBS洗滌5 min×3次；⑵滴加二抗（B試劑），37°C ，30 min，室溫下PBS洗滌5 min×3次；⑶滴加C試劑，37°C ，30 min，室溫下PBS洗滌5 min×3次；⑤DAB顯色：滴加新鮮配置單DAB顯色液，室溫下放置3-10 min，至顯棕色為止，蒸餾水終止反應(yīng)，并洗滌；⑥蘇木素復(fù)染，3-4 min后流水沖洗；⑦分化：1%鹽酸酒精中浸泡1-2 s后流水沖洗；⑧藍(lán)化：氨水中浸泡30s-1 min后流水沖洗；⑴脫水；⑵透明；⑶中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測HER2表達(dá) 兔抗人HER2抗體按預(yù)實驗結(jié)果1：200稀釋，室溫靜置備用。步驟同\"免疫組織化學(xué)法檢測p-STAT3表達(dá)狀況\"。

1.3結(jié)果判斷

1.3.1組織p-STAT3表達(dá)水平的結(jié)果判定 免疫組化染色結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色深度綜合判斷，以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核中出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[8]按3分制計分：0，陰性或陽性細(xì)胞數(shù)<5%；①陽性強(qiáng)度弱或陽性細(xì)胞數(shù)<20%；②強(qiáng)陽性或陽性細(xì)胞數(shù)≥20%。其中0分視為陰性，1分和2分均視為陽性。以上標(biāo)準(zhǔn)均隨機(jī)選取5個高倍視野，計數(shù)500個細(xì)胞，計算出其中陽性細(xì)胞的百分率。

1.3.2組織HER2表達(dá)水平的結(jié)果判定 免疫組化染色結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色深度綜合判斷，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[8]判斷標(biāo)準(zhǔn)為：-：無著色； +：任何比例的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細(xì)胞膜著色；++：>10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度、完整但不均勻的細(xì)胞膜棕黃著色或<30%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜棕褐著色；+++：>30%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的、完整的細(xì)胞膜棕褐著色。IHC法HER2-/+者判定為HER2陰性；HER2++、+++者判定為HER2陽性。以上結(jié)果均由兩位高年資的病理科醫(yī)生評估。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Spearman相關(guān)分析對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

根據(jù)乳腺癌ER、PR、HER2的不同表達(dá)情況將乳腺癌分為 Luminal A型，Luminal B型，HER-2（+）型，basal-like型，采用上述四種分子分型的乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤組織，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察p-STAT3、HER2的蛋白表達(dá)情況。IHC結(jié)果示p-STAT3蛋白主要分布在細(xì)胞核內(nèi)（圖H），HER2蛋白主要定位于細(xì)胞膜上（圖E），在乳腺纖維腺瘤中HER2及p-STAT3蛋白的表達(dá)均呈陰性（圖A、B）；在乳腺癌各分子亞型中的表達(dá)情況分別如下圖中所示。

3 討論

近年來乳腺癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤細(xì)胞中抗凋亡和促進(jìn)分化增殖的作用越來越受到重視，其中，信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化蛋白家族途徑的研究尤為突出。有超過40種的細(xì)胞外多肽物質(zhì)可以與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，從而引發(fā)胞漿內(nèi)STATs的活化。迄今為止，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的STAT家族包括7個成員，它們廣泛表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中，參與細(xì)胞的生長、惡性轉(zhuǎn)化及凋亡等功能的調(diào)控。STAT3作為STATs的重要成員，可以通過直接或間接調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化和血管生存等方面發(fā)揮著重要作用，并在多種腫瘤中異常表達(dá)，例如：白血病、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肝癌等[9，10]。在某些細(xì)胞外因子作用下，STAT3磷酸化激活，通過SH2結(jié)構(gòu)域形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，實驗中我們觀察到p-STAT3主要定位于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)（圖H），與文獻(xiàn)報道相一致；生理狀態(tài)下，細(xì)胞中STAT3的激活短暫，但在惡性腫瘤細(xì)胞中STAT3被持續(xù)激活，這也與我們上述實驗結(jié)果相符合（圖H）。有研究顯示，乳腺癌p-STAT3的表達(dá)較乳腺良性病變顯著增高，這與我們實驗中所觀察到的結(jié)果相符，并且其表達(dá)與乳腺癌的瘤體大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示p-STAT3在乳腺癌的生長、侵襲等惡性演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用[11]。Horiguchi等[12]通過免疫組化分析認(rèn)為p-STAT3的高表達(dá)與腎癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)。

本實驗通過檢測術(shù)后乳腺癌組織各亞型中HER2及p-STAT3的表達(dá)情況，分析二者的相關(guān)性，得出二者在各亞型中呈正相關(guān)關(guān)系，表明HER2在亞型中的表達(dá)情況與p-STAT3的表達(dá)情況近似一致，初步認(rèn)為p-STAT3可補(bǔ)充現(xiàn)有的乳腺癌分子分型，且HER2很可能通過激活p-STAT3引起乳腺癌的惡性生物學(xué)行為。

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編輯/哈濤