移蟲日齡對蜂王生長發(fā)育的影響

龐 倩，沈 芳，殷 玲，吉 挺*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.阜陽市畜牧獸醫(yī)局，安徽阜陽23600；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

移蟲日齡對蜂王生長發(fā)育的影響

龐 倩1，沈 芳2，殷 玲3，吉 挺1*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.阜陽市畜牧獸醫(yī)局，安徽阜陽23600；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

移取1、2、3日齡工蜂幼蟲進(jìn)行人工育王，通過HPLC-MS的方法，分別測定4日齡蜂王幼蟲體內(nèi)保幼激素(JHⅢ)和9日齡蛹體內(nèi)蛻皮激素(Ecd)的滴度，并通過形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)的方法對不同移蟲日齡培育的處女王的初生重、卵巢重、頭重和卵巢管數(shù)進(jìn)行比較分析，以研究不同移蟲日齡對意大利蜂蜂王生長發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，不同移蟲日齡所培育的蜂王幼蟲4日齡JHⅢ和9日齡Ecd濃度均存在顯著差異，且隨著移蟲日齡的增加，蜂王幼蟲體內(nèi)JHⅢ和Ecd含量均顯著下降；不同移蟲日齡所培育的處女王其初生重、卵巢重、頭重及卵巢管數(shù)均存在顯著差異，且隨著移蟲日齡的增加，蜂王的初生重、卵巢重和頭重顯著減輕,蜂王的卵巢管數(shù)顯著減?。环渫醯某跎睾吐殉补軘?shù)成顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.82。說明移蟲日齡越小幼蟲獲得的生長條件越好，越有利于蜂王個體尤其是繁殖性狀的發(fā)育，人工育王實踐中應(yīng)移取蟲齡盡量小的幼蟲。

蜂王；移蟲日齡；生長發(fā)育

蜜蜂有3種類型分別是工蜂、雄峰和蜂王，3種類型的蜜蜂在生長發(fā)育中都需要經(jīng)過卵、幼蟲、蛹和成蟲4個階段(白紅玲和韓偉，2013)。一般一個蜂群中頭會有一頭蜂王，并且決定著蜂群質(zhì)量的好壞，因此研究蜂王的生長發(fā)育對生產(chǎn)實踐具有指導(dǎo)意義。

在實際的人工育王生產(chǎn)中，移蟲日齡對蜂王的生殖發(fā)育影響較大，移蟲時間越晚，繁殖性能受影響越大,但是移蟲時間越早，蜂群對王臺的接受率就越低，因此尋找到最佳的移蟲時間是蜜蜂育種工作中的關(guān)鍵點和難點，而移蟲日齡對蜂王生殖發(fā)育影響的分子機理的解析將為這一難點的突破提供理論依據(jù)。而當(dāng)前關(guān)于蜂王發(fā)育機理的研究中，眾多研究者關(guān)注于3日齡前后幼蟲差異導(dǎo)致的發(fā)育差異及其分子機制(Weaver,1957；Woyke,1971；Hardieetal.,1982)，而關(guān)于移取不同蟲齡的幼蟲育王所引起差異的研究較少。本研究針對養(yǎng)蜂生產(chǎn)實際中移蟲日齡對蜂王生殖性能的影響，移取1、2、3日齡工蜂幼蟲進(jìn)行人工育王，分別測定4日齡蜂王幼蟲體內(nèi)JHⅢ和9日齡蛹體內(nèi)Ecd的滴度，并對不同移蟲日齡培育的處女王的初生重、卵巢重、頭重和卵巢管數(shù)進(jìn)行比較分析，以研究蜂王幼蟲3日齡內(nèi)的外部環(huán)境對意大利蜂蜂王生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

單雄授精的意大利蜂王。

甲醇、乙腈(均為色譜純，美國Fisher公司)，JHⅢ、Ecd標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)

限王產(chǎn)卵器、昆蟲培養(yǎng)箱、精密電子天平、立體解剖顯微鏡；離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1100，美國安捷倫公司產(chǎn)品)；AS3120超聲波清洗機(奧特賽恩斯儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1100高效液相色譜儀，配有二極管陣列DAD檢測器，美國安捷倫公司產(chǎn)品)。

1.2 試驗方法

1.2.1 蜂王的培育

滅菌后的空巢脾，放入限王產(chǎn)卵器中，經(jīng)工蜂清理24 h后，控制蜂王產(chǎn)卵6 h，將空脾轉(zhuǎn)移到繼箱中孵育。98 h后移取巢脾上的幼蟲為1日齡幼蟲，122 h后移取巢脾上的幼蟲為2日齡，146 h后移取巢脾上的幼蟲為3日齡。培育至蜂王出房的前一天，全部轉(zhuǎn)移到昆蟲培養(yǎng)箱等待蜂王出房。

1.2.2 蜂王幼蟲激素的測定

通過HPLC-MS的方法，分別測定4日齡蜂王幼蟲體內(nèi)JHⅢ和9日齡蛹體內(nèi)Ecd的滴度。

1.2.3 蜂王出房重、頭重及卵巢重的測定

蜂王出房后，隨機選擇35頭處女王用精密電子天平稱量其出房重。蜂王稱重后解剖蜂王，分別稱量頭重和卵巢重。

1.2.4 蜂王卵巢管計數(shù)

參考許少玉等(1984)的方法進(jìn)行蜂王卵巢小管的計數(shù)。把切段后的卵巢置于干凈的載玻片上，然后滴幾滴蒸餾水，在解剖顯微鏡下用昆蟲針輕輕的將卵巢小管分離并計數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件對本實驗中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 移蟲日齡對蜂王幼蟲JHⅢ和Ecd滴度的影響

通過HPLC-MS的方法測定4日齡幼蟲體內(nèi)JHⅢ濃度和9日齡蛹體內(nèi)Ecd濃度，結(jié)果見圖1。如圖所示，隨著移蟲日齡的增加，4日齡幼蟲體內(nèi)JHⅢ濃度不斷降低。1日移蟲的幼蟲體內(nèi)JHⅢ濃度最高，且極顯著高于2日齡移蟲幼蟲(P<0.01)；3日齡移蟲的幼蟲體內(nèi)JHⅢ濃度最低，且極顯著低于1日齡和2日齡移蟲的幼蟲(P<0.01)。9日齡蛹體內(nèi)Ecd濃度和4日齡幼蟲體內(nèi)JHⅢ濃度變化趨勢一樣，隨著移蟲日齡的增加，濃度不斷降低，并且不同移蟲日齡蛹體內(nèi)Ecd濃度差異極顯著(P<0.01)。

2.2 移蟲日齡對蜂王初生重和頭重的影響

移蟲日齡對蜂王出房重和頭重的影響見表1。由結(jié)果可知，隨著移蟲日齡的增加，蜂王出房重和頭重降低，各移蟲日齡間基本存在顯著差異。1日齡移蟲組蜂王出房重和頭重都極顯著高于2日齡和3日齡移蟲組蜂王(P<0.01)；2日齡移蟲組蜂王出房重極顯著高于3日齡移蟲組蜂王(P<0.01)，2日齡和3日齡移蟲組蜂王頭重差異不顯著(P>0.05)。

圖1 移蟲日齡對蜂王幼蟲JHⅢ和Ecd濃度的影響Fig.1 The effect of the instar of the grafted larvae on the queen larvae JH and Ecd titer

分組Groups出房重(mg)Birthweight頭重(mg)Headweight1日齡組1instargroup23124±038A1370±115A2日齡組2instarsgroup21905±456B1266±134Ba3日齡組3instarsgroup19084±582C1226±152Bb

注：相同字母代表差異不顯著，不同的小寫字母代表差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母代表差異極顯著(P<0.01)。表2同。Note: The same letters represent no significant difference. The different small letters represent significant difference(P<0.05). Different capital letters represent extremely significant difference (P<0.01).Same to table 2.

2.3 移蟲日齡對蜂王卵巢重和卵巢管數(shù)的影響

移蟲日齡對蜂王卵巢重和卵巢管數(shù)的影響見表2。結(jié)果顯示，隨著移蟲日齡的增加，卵巢重量降低，卵巢管數(shù)減少。各日齡蜂王卵巢重和卵巢管數(shù)之間存在極顯著差異(P<0.01)，并且，隨著移蟲日齡的增加，卵巢重量和卵巢管數(shù)變化趨勢相同。

2.4 蜂王卵巢管數(shù)和蜂王初生重的關(guān)系

蜂王初生重與卵巢管數(shù)的相關(guān)性研究結(jié)果見圖2。從圖可知，蜂王初生重和蜂王卵巢管數(shù)呈線性關(guān)系：y=1.1379x+19.52，相關(guān)系數(shù)r=0.82，表明蜂王初生重和蜂王卵巢管存在顯著正相關(guān)。因此，生產(chǎn)中應(yīng)該選擇初生重更高的處女王。

表2 移蟲日齡對蜂王卵巢重和卵巢管數(shù)的影響

圖2 蜂王初生重和卵巢管數(shù)的相關(guān)性Fig. 2 The correlation between queen birth weight and the number of ovarian tube

3 結(jié)論與討論

3.1 移蟲日齡對幼蟲保幼激素和蛻皮激素的影響

蜂王漿的質(zhì)和量對蜜蜂的發(fā)育以及級型分化起著關(guān)鍵作用，移蟲日齡的不同即主要體現(xiàn)在飼喂蜂王漿的不同，而蜂王漿的作用則是通過對JH的影響達(dá)到的(Riddifordetal., 2010)。JH有三種同系物，即JHⅠ、JHⅡ和JHⅢ，而在蜜蜂中僅發(fā)現(xiàn)了JHⅢ(嵇保中等，2007)。在蜜蜂幼蟲期，其體內(nèi)JHⅢ發(fā)生兩次上升過程，而且蜂王幼蟲體內(nèi)JHⅢ滴度遠(yuǎn)高于工蜂幼蟲。在幼蟲發(fā)育到4-5 d的時候，體內(nèi)JHⅢ滴度會出現(xiàn)一個峰值，該峰值決定了幼蟲級型的發(fā)育方向(Jinetal.，2011)。JHⅢ的主要作用包括保持幼蟲的特性、調(diào)控昆蟲的發(fā)育、變態(tài)和生殖等過程(Shelbyetal.，2007； Riddifordetal.,2010；Hirumaetal.,2013)還可以提高脂肪體中卵黃蛋白原基因的轉(zhuǎn)錄水平，促使卵黃蛋白原合成速率提高，滿足卵巢的需求，與幼蟲期卵巢的發(fā)育密切相關(guān)，JH的缺乏是導(dǎo)致成蟲滯育的主要內(nèi)因之一(董颯，2012)。在蜜蜂幼蟲發(fā)育過程中大量的蜂王漿能夠改變成熟幼蟲中JHⅢ的濃度，由于濃度的差異，可以激活幼蟲體內(nèi)不同的發(fā)育模式，得到充足蜂王漿的蜂王成熟早，生殖器官發(fā)育完全，工蜂則因為得到較少的蜂王漿而成熟晚，生殖器官發(fā)育不完全，從而使得雌性幼蟲發(fā)育成完全不同的兩種級型——具有繁殖能力的蜂王和沒有繁殖能力的工蜂(彭文君，2007；陳璇，2012；丁桂玲，2014)。本實驗測定了不同移蟲日齡的4日齡蜂王幼蟲體內(nèi)的JHⅢ滴度，結(jié)果顯示，不同移蟲日齡的幼蟲血淋巴JHⅢ滴度差異極顯著，并且移蟲日齡越大，血淋巴JHⅢ滴度越低。

在蜜蜂體內(nèi)，Ecd和JHⅢ相互作用，JHⅢ可以啟動Ecd的生物合成，調(diào)控Ecd的分泌(Rachinskyetal.，2002；周嬌等，2013)，二者共同調(diào)節(jié)蜜蜂的發(fā)育和變態(tài)過程。另外，有研究指出營養(yǎng)條件能夠引起成蟲體內(nèi)Ecd滴度的變化(Terashimaetal.，2005)。本研究中不同移蟲日齡的9日齡蜂王蛹，表現(xiàn)出顯著不同的Ecd濃度，并且，移蟲日齡越大，Ecd滴度越低，分析原因可能是由于JHⅢ滴度的不同導(dǎo)致啟動Ecd合成的能力不同，再加上飼喂王漿的不同從而最終導(dǎo)致移蟲日齡越小的幼蟲其體內(nèi)Ecd滴度越高，高濃度的Ecd可以促進(jìn)幼蟲過渡到蛹期，縮短幼蟲期，促進(jìn)蜂王相對于工蜂更快的發(fā)育。而移蟲越晚，幼蟲體內(nèi)Ecd滴度越低，發(fā)育較為遲緩，發(fā)育狀態(tài)越接近工蜂。

對不同移蟲日齡蜂王幼蟲的JHⅢ和Ecd測定的結(jié)果表明，兩種激素滴度呈現(xiàn)出隨著移蟲日齡的增加而減少的趨勢，并且各組之間差異顯著。究其原因，主要是1日齡移蟲組的幼蟲最先被移到王臺并獲得“王臺王漿”的飼喂，3日齡移蟲組幼蟲最后被移到王臺，結(jié)合前人的研究結(jié)果，幼蟲所處巢房的大小會影響幼蟲的發(fā)育(Shietal.，2011)，同時蜂群中的外激素也會影響工蜂巢中幼蟲的發(fā)育(黃少康，2005)，并且工蜂蜂房所飼喂的“蜂房王漿”與在蜂王王臺所飼喂的“王臺王漿”其組分上是否存在差異有待于進(jìn)一步研究，這些因素共同造成幼蟲發(fā)育狀態(tài)的不同，最終導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)JHⅢ和Ecd的顯著差異。

3.2 移蟲日齡對蜂王形態(tài)指標(biāo)的影響

蜂王初生重是評價蜂王質(zhì)量的重要指標(biāo)，大量研究表明蜂王的初生重與其卵巢管數(shù)呈線性正相關(guān)，幼蟲初生重越大，蜂王的卵巢管數(shù)越多，繁殖性能越好。本研究中蜂王初生重和卵巢管相關(guān)系數(shù)為r=0.82，和陳世璧(1991)的研究結(jié)果一致。

本研究中隨著日齡的增加蜂王的初生重、頭重和卵巢管數(shù)均降低，和前人研究結(jié)果一致(Woyke，1971)，說明移蟲的日齡越小，培育的蜂王質(zhì)量越好。之所以不同移蟲日齡蜂王的發(fā)育情況存在顯著差異，是因為幼蟲所獲得的食物不同。在王臺中的幼蟲可以得到哺育蜂更多的照顧，分到充足的王漿，而工蜂房中的幼蟲相對于王臺中的幼蟲處于營養(yǎng)匱乏狀態(tài)。另外，高濃度的JH可以促進(jìn)蜂王卵巢的發(fā)育，有國內(nèi)的學(xué)者通過在蜜蜂蜂王幼蟲食物中添加JH類似物，顯著提高了蜂王的初生重、促進(jìn)卵巢的發(fā)育，這進(jìn)一步證明蜂王初生重和卵巢管數(shù)與幼蟲體內(nèi)JH滴度都是彼此成正相關(guān)。

蜂王卵巢管數(shù)直接決定蜂王的產(chǎn)卵力，是評價蜂王質(zhì)量的決定性指標(biāo)(Gilleyetal.，2003；王靜，2012)。本研究中隨著移蟲日齡的增加蜂王幼蟲JHⅢ和Ecd滴度降低，蜂王卵巢管數(shù)量極顯著降低，表明移蟲日齡越小，蜂王的質(zhì)量越高。生產(chǎn)中應(yīng)該選擇日齡盡量小的幼蟲來培育高質(zhì)量的蜂王，以確保蜂群的群勢和生產(chǎn)性能。

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Study on the effect of instar of the grafted larvae on the queen growth and development

PANG Qian1, SHEN Fang2, YIN Ling3, JI Ting1*,

(1.College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 22500, Jiangsu Province, China; 2.Fuyang Animal Husbandry and Veterinary Burean,Fuyang 23600,Anhui Province, China; 3.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, Jiangsu Province, China)

The objective of this study is to research the effect of the instars of the grafted larvae on queen growth and development. The HPLC-MS was used to determine the JHⅢ titer of 4 d larvae and the Ecd titer of 9 d larvae, methods of morphology and anatomy were used to measured correlated parameters on queen of different instar of the grafted larvae. Including the birth weight, ovary weight, head weight and ovariole number. The results indicated that there were significant differences among the JHⅢ titer of 4 days larvae and the Ecd titer of 9 d larvae grafted in different instars. And the older the larvae grafted, the more significant differences showed. And birth weight, ovary weight, head weight and ovariole number were significantly reduced with the increase of grafted instar. The ovaries number is significantly and positively correlate with the birth weight (r=0.82). All of the results indicated that the earlier the larvae grafted, the earlier the better conditions the larvae get, the better development status of the queen. So, we should choose as early as possible of the worker larvae to foster the queen bee.

Queen bee; grafting instar of larvae; development

國家自然科學(xué)基金(31502020，31172272)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-45-SYZ6)

龐倩，女，1994年生，安徽宿州人，碩士研究生，E-mail：18852717155@163.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail：tji@yzu.edu.cn

Received：2016-02-29；接受日期Accepted：2016-04-19

Q965;S892.5

A

1674-0858(2017)01-0093-05

龐倩，沈芳，殷玲，等.移蟲日齡對蜂王生長發(fā)育的影響[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(1):93-97.