毛細(xì)管電色譜及其在手性分離中的應(yīng)用

【摘 要】毛細(xì)管電色譜（CEC）作為一種新興的高效微分離技術(shù)，具有高分離率、高選擇性和快速分離等特點(diǎn)。本文介紹了毛細(xì)管電色譜技術(shù)的研究進(jìn)展、基本原理及其分類，系統(tǒng)綜述了CEC在手性分離中的應(yīng)用，指出了其存在的問題并對CEC的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

【關(guān)鍵詞】毛細(xì)管電色譜 手性分離 綜述

【中圖分類號(hào)】R917 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-4810（2014）14-0078-02

毛細(xì)管電色譜（CEC）是近年來迅速發(fā)展起來的一種結(jié)合了高效液相色譜（HPLC）高選擇性和毛細(xì)管電泳（CE）高效性的微分離技術(shù)，屬于高效毛細(xì)管電泳（HPCE）的一種。它是將固定相填充在毛細(xì)管中，或把固定相涂布、鍵合于毛細(xì)管壁上，使用電滲流（EOF）或電滲流結(jié)合壓力流作為流動(dòng)相推動(dòng)力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，通過樣品中各組分在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)、滲透系數(shù)、電泳淌度或離子對作用不同來進(jìn)行分離的一種電分離模式。

相對于常規(guī)的液相色譜，毛細(xì)管電色譜的峰擴(kuò)展只與溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)，這是因?yàn)镃EC克服了HPLC中流速不均勻的壓力流引起的峰擴(kuò)展，而且電色譜柱內(nèi)沒有壓降，使毛細(xì)管電色譜的理論塔板數(shù)得到了大幅提高，高于高效液相色譜，接近于毛細(xì)管電泳的理論塔板數(shù)。同時(shí)，因?yàn)榻Y(jié)合了HPLC固定相和流動(dòng)相可選擇種類多的優(yōu)點(diǎn)，使用CEC分離中性化合物或中性及帶電成分的混合樣品時(shí)不需要加入表面活性劑。與其他的分離分析技術(shù)相比，CEC具有高效性、高分離率、高選擇性以及分析速度快、試劑消耗少等突出優(yōu)點(diǎn)。

一 毛細(xì)管電色譜的研究進(jìn)展

毛細(xì)管電色譜技術(shù)的起源可以追溯到1952年，Mould采用電場在薄層液相色譜中分離寡糖，但直到1974年才由Pretorius等指出在柱色譜中采用電滲流取代泵作為流動(dòng)相推動(dòng)力的巨大優(yōu)越性。1981年，Jogenson等將粒徑為10μm的Partisil ODS-2填充入170μm內(nèi)徑的毛細(xì)管中，分離得到了9-甲基蒽等多環(huán)芳烴，第一次向世人展示了毛細(xì)管電色譜在化合物分離方面的巨大潛力。隨后，Knox等對大量有關(guān)填充柱電色譜的理論問題進(jìn)行了進(jìn)一步研究，弄清了電色譜中影響峰展寬的因素，以及填料粒徑大小及流動(dòng)相中電解質(zhì)濃度與電色譜柱柱效、電滲流速度之間的關(guān)系。至此，建立了有關(guān)電色譜法的基礎(chǔ)理論。1998年，Bayer等首次將毛細(xì)管電色譜與核磁共振實(shí)現(xiàn)聯(lián)用。2000年，Chen等成功應(yīng)用毛細(xì)管電色譜和電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)分析金屬離子。2005年，林子俺等實(shí)現(xiàn)了加壓毛細(xì)管電色譜與安培檢測技術(shù)的聯(lián)用；隨后，又于2006年實(shí)現(xiàn)了與化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的聯(lián)用。毛細(xì)管電色譜作為一種新興的分離分析技術(shù)，發(fā)展歷史還不長，但其在理論、技術(shù)及儀器等方面都取得了較大的發(fā)展，并逐步被廣泛應(yīng)用于環(huán)境檢測、食品安全、藥物分離、生命科學(xué)等領(lǐng)域。

毛細(xì)管電色譜分離的核心是電色譜柱，根據(jù)毛細(xì)管柱中固定相的不同存在形式，可分為填充毛細(xì)管電色譜柱、開管毛細(xì)管電色譜柱和整體毛細(xì)管電色譜柱三種。

填充毛細(xì)管電色譜柱就是把常用的高效液相色譜固定相填料作為分離基質(zhì)，填充在不同孔徑的毛細(xì)管內(nèi)，采用電滲流或電滲流結(jié)合壓力流作為流動(dòng)相推動(dòng)力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，進(jìn)而使樣品實(shí)現(xiàn)分離。

開管毛細(xì)管電色譜柱亦即鍵合色譜涂層毛細(xì)管柱，就是用各種硅烷化試劑修飾毛細(xì)管內(nèi)壁，形成一層硅烷化的涂層，通過樣品中不同組分在涂層上的分配系數(shù)不同，采用電滲流或電滲流結(jié)合壓力流驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相對樣品進(jìn)行分離。

整體毛細(xì)管電色譜柱，又稱為棒狀柱（rod column）、連續(xù)床層（continuous bed）、無塞柱（fritless column），是在毛細(xì)管柱中采用有機(jī)或無機(jī)聚合方法形成連續(xù)、整體、多孔的固定相的一種電色譜分離模式。

二 毛細(xì)管電色譜在手性分離中的應(yīng)用

手性化合物尤其是手性藥物對映體在手性環(huán)境中生物活性有很大的差別，因此應(yīng)用于臨床研究及質(zhì)量控制的簡單快速的手性藥物對映體分離分析方法的建立與發(fā)展，已引起了醫(yī)藥界的極大關(guān)注。毛細(xì)管電色譜作為毛細(xì)管電泳和高效液相色譜的雜交體，兼具了高分離率、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，近年來，已成為手性拆分強(qiáng)有力的工具，受到極大的關(guān)注。

目前，毛細(xì)管電色譜手性拆分主要有兩種模式：手性流動(dòng)相-非手性固定相模式，手性固定相-非手性流動(dòng)相模式。

1.手性流動(dòng)相-非手性固定相模式

與傳統(tǒng)的HPCE手性拆分相似，手性流動(dòng)相-非手性固定相模式就是動(dòng)態(tài)地將手性選擇劑加入基礎(chǔ)電解質(zhì)流動(dòng)相中，采用ODS柱、C18柱等常規(guī)的非手性柱拆分手性藥物。目前常用的手性添加劑主要有環(huán)糊精、蛋白質(zhì)、冠醚、金屬離子配合物、大環(huán)抗生素等，其中環(huán)糊精（CDs）應(yīng)用最多。

Lammerhofer等在背景電解質(zhì)中加入了帶正電的奎寧氨基甲酸酯，利用非手性O(shè)DS固定相與手性添加劑和帶負(fù)電荷的各種氨基酸對映體形成的離子對之間具有不同作用的特點(diǎn)，對氨基酸進(jìn)行手性分離。辛艷飛等以反相C18柱為固定相，天冬氨酰苯丙氨酸甲酯為手性選擇體，Cu2+為配體離子，成功建立了毛細(xì)管電色譜手性配體交換法分離游離亮氨酸異構(gòu)體的方法。李英杰等以羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）作為手性選擇劑使1-甲基-3-苯基丙胺對映體實(shí)現(xiàn)了手性分離。

手性拆分時(shí)，手性流動(dòng)相-非手性固定相模式與手性固定相-非手性流動(dòng)相模式相比，需要的手性選擇劑量很大，價(jià)格昂貴，但分離效率低，不夠經(jīng)濟(jì)，且在流動(dòng)相中，手性添加劑的溶解度有限制。因此手性流動(dòng)相-非手性固定相模式主要只用于對合適的手性添加劑進(jìn)行選擇，再通過需要的手性添加劑來制備手性固定相。

2.手性固定相-非手性流動(dòng)相模式

手性固定相-非手性流動(dòng)相模式是將手性選擇劑涂布或鍵合在固定相載體表面，制備得到手性固定相。拆分手性對映體時(shí)，由于各組分與手性固定相之間生成的復(fù)合物穩(wěn)定性不同，使其在色譜柱中具有不同的保留時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)手性對映體的分離。根據(jù)手性選擇劑的種類不同，可將手性固定相分為以下幾類：

第一，環(huán)糊精型鍵合固定相。環(huán)糊精及其衍生物手性固定相由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，對手性對映體有較好的識(shí)別能力，已廣泛應(yīng)用于GC、HPLC、SFC、CE中。其中應(yīng)用最多的是β-CD，以β-CD和β-CD衍生物作為手性選擇劑的固定相已被用于許多化合物的手性拆分。

Tian等使用新型環(huán)糊精衍生物修飾聚甲基丙烯酸酯整體柱，在毛細(xì)管電色譜模式下分離了布洛芬和萘普生。戴榮繼等制備了β-CD衍生化胰酶毛細(xì)管電色譜柱。在加壓毛細(xì)管電色譜模式下，利用該柱很好地分離了色氨酸、氯苯那敏、布洛芬、異丙嗪和阿托品等對映異構(gòu)體。楊麗等采用毛細(xì)管電色譜法，以β-環(huán)糊精修飾的納米金顆粒（GNPs）為準(zhǔn)固定相對四種氨基酸對映體進(jìn)行手性分離，其分離度都達(dá)到了1.7以上。呂仁江等采用原位聚合法，制備了聚丙烯酸酯-β-環(huán)糊精手性毛細(xì)管整體柱，首次拆分了鹽酸依替福林對映體。

第二，蛋白質(zhì)鍵合型固定相。蛋白質(zhì)對很多手性對映體都具有良好的對映選擇性，且有較廣的應(yīng)用范圍。Kato等將硅溶膠與牛血清白蛋白（BSA）混合，制備得到包覆型硅膠基質(zhì)整體柱用于分離色氨酸對映體。Machtejevas等通過親核開環(huán)反應(yīng)制備了帶乙烯基的人血清白蛋白衍生物，用于制備手性聚丙烯酰胺毛細(xì)管電色譜整體柱。鄭翌等基于甲基丙烯酸酯整體柱表面所帶環(huán)氧基團(tuán)具有較強(qiáng)反應(yīng)活性的特征，將牛血清白蛋白直接鍵合到其表面，制備成牛血清白蛋白手性固定相毛細(xì)管整體柱，成功拆分了手性藥物華法林和四種手性對映體。

第三，分子印跡手性固定相。分子印跡手性固定相就是以待分離的手性分子中的一種作為模板分子，采用一定的聚合方法與功能單體、交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)，制備得到對模板分子具有高度選擇性的分子印跡聚合物（MIP）來作為手性固定相，結(jié)合毛細(xì)管電色譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對對映體的手性拆分。

Ou等制備了L-四氫帕馬丁（L-THP）和（S）-朝格爾堿[（S）-TB]的分子印跡毛細(xì)管電色譜整體柱，在加壓CEC模式下4 min內(nèi)可拆分THP和TB的對映體。Spegel等以S-布洛芬為模板分子，分別以甲醛丙烯酸甲酯（MMA）和2-乙烯基吡啶（2-VP）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑制備MIP作為手性固定相，成功拆分了布洛芬對映體。李燕麗等以（S）-腺苷蛋氨酸為模板分子，采用熱引發(fā)一步法，制備了具有手性識(shí)別能力的分子印跡毛細(xì)管整體柱。

第四，大環(huán)抗生素手性固定相。大環(huán)抗生素萬古霉素、替考拉寧等分子中一般具有多個(gè)手性空腔和手性中心，對手性對映體分子有很強(qiáng)的識(shí)別能力。因此，大環(huán)抗生素手性固定相在毛細(xì)管電色譜手性分離上的應(yīng)用也引起了人們的極大興趣。

Wikstrom等在diol硅膠上鍵合萬古霉素，然后通過反相和極性有機(jī)模式，成功實(shí)現(xiàn)了沙利度胺等十種手性藥物的分離。Komysova等利用酸水解整體柱表面的環(huán)氧基得到偕二醇基，然后使用高碘酸鈉將偕二醇基氧化成醛基，最后通過還原胺化反應(yīng)連接上萬古霉素，制備得到的手性CEC整體柱能在10min內(nèi)高效快速地拆分沙利度胺對映體。丁國生等以去甲萬古毒素為手性選擇劑，對采用溶膠-凝膠技術(shù)制備的毛細(xì)管硅膠整體柱進(jìn)行化學(xué)衍生，成功制備了去甲萬古毒素鍵合手性硅膠整體柱。

三 結(jié)束語

作為一種新興的手性分離方法，毛細(xì)管電色譜由于兼具高分離率、高選擇性、流動(dòng)相相對簡單、峰容量大等優(yōu)點(diǎn)，在手性分離方面的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注，但CEC的對映體選擇技術(shù)還處于起步階段，且手性分離時(shí)，電色譜柱柱效普遍偏低，因此，對毛細(xì)管電色譜柱的分離機(jī)制和柱制備技術(shù)進(jìn)行全面的研究，以提高對映體分離選擇性和柱效是CEC未來研究的前沿。相信，隨著CEC技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展完善，它將成為手性分離色譜研究的一個(gè)新方向。

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〔責(zé)任編輯：高照〕