熒光定量RT-PCR在流感病毒檢測(cè)上的應(yīng)用研究

摘要：目的：探討實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR在流行性感冒檢測(cè)上的臨床診斷意義。方法：收集阿壩州人民醫(yī)院臨床就診及住院病人流感樣病例標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)流感病毒核酸，陽(yáng)性標(biāo)本用狗腎傳代細(xì)胞（MDCK）培養(yǎng)、分離流感病毒，比較兩種檢測(cè)方法的靈敏度。結(jié)果：在613份標(biāo)本中，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性160份，陽(yáng)性率為26.1%；MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒82株，陽(yáng)性率為13.4%，兩者的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：實(shí)時(shí)熒光RT-PCR可以作為一種快速有效的流感病毒核酸檢測(cè)法，且操作方便，特異性強(qiáng)，靈活度高，可以廣泛適用于公共衛(wèi)生應(yīng)急疫情的實(shí)驗(yàn)室快速診斷流感；而細(xì)胞培養(yǎng)法作為流感病原學(xué)監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)，主要用于核實(shí)暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室診斷，對(duì)病毒進(jìn)行抗原性和基因特性的分析。

Abstract：Objective：To investigate the clinical diagnostic significance of real time fluorescence quantitative RT-PCR in detection of influenza.Methods： to collect People’s Hospital of Aba Prefecture clinical treatment and hospitalization of influenza like patients specimens， the application of real-time fluorescent RT-PCR for detection of influenza virus nucleic acid， positive samples with Madin Darby canine kidney cells （MDCK） culture， isolation of influenza virus， to compare the sensitivity of two kinds of detection methods.Results： among the 613 specimens， 160 were positive by real-time fluorescent RT-PCR detection， the positive rate was 26.1%； MDCK cell culture method for the separation of 82 influenza virus strains， the positive rate was 13.4%， the difference was statistically significant positive rate between the two.Conclusion： the real time fluorescence RT-PCR can be used as a kind of influenza virus nucleic acid detection method is fast and effective， and has the advantages of convenient operation， strong specificity， high sensitivity， rapid diagnosis of influenza can be widely used in public health emergency epidemic laboratory；The cell culture method as the influenza monitoring etiology based， mainly used for laboratory diagnosis was verified outbreak， analysis of the antigenic and genetic characteristics of the virus。

關(guān)鍵字：實(shí)時(shí)熒光RT-PCR；流感病毒；細(xì)胞培養(yǎng)；

【中圖分類號(hào)】R511 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-8602（2014）10-0012-01

流感就是流行性感冒，它的臨床癥狀跟普通的感冒癥狀相似，最終需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)進(jìn)行確診，在實(shí)驗(yàn)室的診斷中，最直接的方法就是采集患者的咽拭字，狗腎臟傳代細(xì)胞（MDCK）進(jìn)行病毒的分離、定型來(lái)進(jìn)行判斷[1]。但是過(guò)去傳統(tǒng)的方法比較消耗時(shí)間和力氣，而目前常用流感病毒治療藥物的最佳使用時(shí)間是在2天以內(nèi)，尤其是對(duì)暴發(fā)疫情的處理，診斷更是要越快越好，所以開(kāi)展流感病毒的快速診斷是非常有必要的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，是由美國(guó)的Applied Biosystems公司在1996年提出來(lái)的。該技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且還具有特異性強(qiáng)、能有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)[2]。目前在實(shí)驗(yàn)室均得到廣泛應(yīng)用。熒光定量PCR法是在PCR反應(yīng)中除加入型、亞型特異物外，同時(shí)加入標(biāo)記熒光的相應(yīng)型、亞型特異核苷酸片段作為探針，探針雜交溫度比PCR反應(yīng)中復(fù)性溫度高5℃，使得它與PCR產(chǎn)無(wú)語(yǔ)雜交，然后利用Taq酶內(nèi)源性5’-3’核酸酶活性，并將未雜交的熒光探針降解，加入淬滅劑消除降解的游離熒光素，最后通過(guò)對(duì)熒光進(jìn)行測(cè)定來(lái)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，這樣就可以避免了以往傳統(tǒng)的PCR后繁瑣的產(chǎn)物分析過(guò)程，然后可以在擴(kuò)增反應(yīng)中隨時(shí)終止反應(yīng)，檢測(cè)即時(shí)PCR產(chǎn)物。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本的采集和處理

對(duì)四川省阿壩州人民醫(yī)院流感暴發(fā)時(shí)就診的流感樣病例，體溫≥38℃，并伴有咳嗽，胸悶等流感樣癥狀的患者咽拭子標(biāo)本3-5ml，并于24h冷藏送至四川省阿壩州疾病預(yù)防控制中心流感實(shí)驗(yàn)室，加入2000u/ml青霉素、2000u/ml鏈霉素和100u/ml多粘菌素B，2-4℃保存?zhèn)溆谩２荒茉?4h接種MDCK細(xì)胞的存儲(chǔ)于-80℃。

1.2 核酸提取

檢測(cè)儀器為Roche品牌，LightCycler2.0卡盤式全自動(dòng)熒光定量PCR儀，反應(yīng)試劑盒由江蘇碩世有限公司提供。

1.3 病毒分離

采用MDCK細(xì)胞分離法來(lái)進(jìn)行病毒分離，將已經(jīng)成長(zhǎng)為單層的MDCK細(xì)胞倒去生長(zhǎng)液，用Hank’s液洗兩遍，加入1ml不含牛血清的維持液，至35℃孵育。第二天開(kāi)始觀察細(xì)胞病變（CPU），當(dāng)出現(xiàn)80%以上的CPU時(shí)凍存。采用微量半加敏血球凝集抑制試驗(yàn)（HI），鑒定性別及亞型[3]。

1.4 熒光RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)流感病毒A型、B型基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物和探針，設(shè)計(jì)反應(yīng)程序：第1步：37℃25min；94℃2min；第2步：94℃15s，55℃15s，72℃20s，5個(gè)循環(huán)；第3步：94℃5s，55℃35s，32個(gè)循環(huán)。在反應(yīng)程序的第3步55℃末讀取熒光值。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

通過(guò)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，在613份標(biāo)本中，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性160份，陽(yáng)性率為26.1%；經(jīng)A、B型流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，分別有140份和20份陽(yáng)性，分別占87.5%和12.5%。

2.2 流感病毒的細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的160份標(biāo)本，經(jīng)過(guò)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)、病毒分離鑒定，獲得82株流感病毒，陽(yáng)性率為51.25%，占全部613份標(biāo)本的13.4%。其中，A型流感病毒陽(yáng)性68份，B型流感病毒陽(yáng)性14份，陽(yáng)性率分別占82.9%和17.1%。

2.3 兩種方法的檢測(cè)結(jié)果比較

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR流感病毒檢出率與細(xì)胞培養(yǎng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，x2=26.5，P<0.005，表明兩者的陽(yáng)性率差異有顯著意義?？梢?jiàn)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率高于MDCK細(xì)胞培養(yǎng)陽(yáng)性率。

3 討論

根據(jù)國(guó)家流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則（GB15994-1995）的標(biāo)準(zhǔn)[4]，流行性感冒病原學(xué)的檢測(cè)方法有常規(guī)的病毒培養(yǎng)法（9-11D齡雞胚與MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法）和快速診斷方法（間接免疫熒光法和間接免疫酶聯(lián)免疫法試驗(yàn)）。這種經(jīng)典的試驗(yàn)方法雖然準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定，但是對(duì)標(biāo)本中的病毒含量要求比較高，必需要達(dá)到雞胚或MDCK培養(yǎng)法所需要的病毒含量[5]，而且對(duì)標(biāo)本的采集、運(yùn)輸、保存等要求比較高，試驗(yàn)步驟繁瑣，確診需耗時(shí)10-15d。

從本研究結(jié)果來(lái)看，MDCK細(xì)胞分離法雖然是流感實(shí)驗(yàn)室最常用、高敏感度、最準(zhǔn)確的方法之一，但是該方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜，在用于流感疫情暴發(fā)時(shí)的快速診斷會(huì)受到制約。所以實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法的應(yīng)用對(duì)提高流感檢測(cè)的靈敏度、快速準(zhǔn)確地處置流感疫情有具有重大意義，在過(guò)去的重大流感暴發(fā)疫情中，都表明使用該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，所需要的時(shí)間短，目前已經(jīng)在流感病毒的核酸檢測(cè)中得到應(yīng)用同時(shí)，同時(shí)，該方法還采用完全閉管式操作，大大減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 郭元吉，程小雯.流行感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)三峽出社.2007

[2] 張萍，韓文清.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與細(xì)胞培養(yǎng)法在流感病毒檢測(cè)中應(yīng)用. 2011（01）：45-47

[3] Stone B，Burrows J，Schepetiuk S，et al. Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by realtime PCR[J]. J Virol Methods，2004，117 （2）：103- 112.

[4] 中華人們共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB15994-19951