血清EBV-DNA檢測(cè)在膿毒血癥中臨床意義

【摘要】背景與目的：血培養(yǎng)是確定膿毒血癥病因的主要手段，據(jù)統(tǒng)計(jì)，最常見的致病菌主要是：大腸桿菌、綠膿桿菌以及Klebsiella肺炎桿菌。但臨床上有很多病例出現(xiàn)血培養(yǎng)陰性，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)血清中EBV成陽性，在血清中監(jiān)測(cè)EBV DNA水平對(duì)血培養(yǎng)陰性膿毒血癥患者的臨床意義尚缺少研究報(bào)道。 EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一種人類皰疹病毒，基因組為雙鏈DNA。世界上90%人群成年前均感染過EBV[1]大多數(shù)正常人攜帶EBV，這種原處于靜止?fàn)顟B(tài)的病毒一旦處于活化狀態(tài)。EBV DNA可整合至細(xì)胞染色體，是EBV持續(xù)潛伏感染的另一種方式，代表了病毒一細(xì)胞相互作用的又一種機(jī)制[2]。本研究定量檢測(cè)膿毒血癥血培養(yǎng)陰性患者血清EBV DNA含量，探討其在監(jiān)測(cè)膿毒血癥發(fā)生和發(fā)展臨床意義。方法：選擇在我院門診隨診的血培養(yǎng)陰性膿毒血癥患者20例和健康成年志愿者20例，用熒光定量PCR方法檢測(cè)血清EBV DNA含量，比較血培養(yǎng)陰性膿毒血癥患者與健康成年志愿者血清EBV DNA拷貝數(shù)。結(jié)果：血培養(yǎng)陰性膿毒血癥患者血清EBV DNA的檢出率為30%，中位拷貝數(shù)為2 650 copies/ml(O -5 900 000 copies/ml)；而正常對(duì)照組患者血清EBV DNA檢出率0%，中位拷貝數(shù)為0 copy/ml(0 - 71000copies/ml)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：血清EBV DNA定量檢測(cè)可證明血培養(yǎng)陰性膿毒血癥患者存在EBV感染的病毒血癥。

【關(guān)鍵詞】膿毒血癥；血培養(yǎng)陰性；熒光定量PCR； EB病毒DNA；

【中圖分類號(hào)】R4【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1671-8801（2014）06-0011-03

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)

本研究擬采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)20例血培養(yǎng)陰性Sepsis患者血清EBV DNA進(jìn)行定量分析，探討血清EBV DNA含量在診斷膿毒血癥中的臨床意義。

1資料和方法

1.1病例資料

選擇自2009年3月至2011年10月在湖南省人民醫(yī)院門診隨診的血培養(yǎng)陰性膿毒血非燒傷致膿毒癥患者20例， 其中男性11例，女性9例，中位年齡49(23 -65)歲。原發(fā)病包括呼吸系統(tǒng)感染10例， 消化系統(tǒng)感染7例， 神經(jīng)系統(tǒng)感染3例。治愈15例， 死亡5例。所有患者入院時(shí)均出現(xiàn)SIRS， 其中并發(fā)MODS 10例， 感染性休克15例。所有病例均排除其他引起血清中EBV感染可能的疾病， 無基礎(chǔ)代謝性疾病， 未行脾及胸腺切除， 不包括腫瘤、自體免疫性疾病等確切影響免疫及使用放、化療和激素、免疫制劑治療者。正常對(duì)照組血清取于22-28歲健康志愿者，既往無EBV感染相關(guān)病史。抽取每個(gè)患者外周血3 ml于分離膠促凝管中，4 000 r/min離心10 min后分離上層血清，于- 80C凍存。

1.2DNA抽提

用QIAmp DNA Blood Kit（購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司）抽提血清DNA，操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3引物及探針的設(shè)計(jì)及合成

引物、探針的設(shè)計(jì)及合成均在上海生工完成。所擴(kuò)增的目的基因來自EB病毒的BamH i-w片段。上、下游引物分別為W-44F（5'-AGTCT CTGCC TCCAG GCA-3’）和W-119R(5’一ACAGA GGGCC TGTCC ACCG-3’)。在該P(yáng)CR反應(yīng)體系中加入一個(gè)雙末端標(biāo)記的熒光探針，探針的序列為5'-(FAM) CACTG TCTGT AAAGT CCAGCCTCC (TAMRA)-3’。上述引物和探針序列資料采集自GenBank序列數(shù)據(jù)庫。

1.4反應(yīng)體系組成

PCR反應(yīng)總體積是50ul，含有10ul的5×Buffer.引物和對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記探針各10 pmol，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各200 umol/L，Taq聚合酶SU，取抽提的血清DNA模板5ul，加入PCR反應(yīng)管中。擴(kuò)增反應(yīng)在PE7700自動(dòng)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。結(jié)果采用專用的分析軟件包SequenceDetection System software(version l.6.3)進(jìn)行分析( Perkin-Elmer AppliedBiosystems)。PCR反應(yīng)條件：開始95℃10 min，93℃45 s，55℃1 min，10個(gè)循環(huán)；然后95℃30 s，55℃45 s，30個(gè)循環(huán)。

1.5對(duì)照的選擇

每批PCR反應(yīng)用克隆合成的EBV DNA-W片段作為陽性對(duì)照，并稀釋成不同濃度梯度(1×107、1×106、1×105、lx 104、1×103、1×102、1×10 copies/ul)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.6血清中EBV DNA含量計(jì)算

血清EBV DNA拷貝數(shù)C=Qx( Vdna／Vpcr)×(l/ Vext)，其中C為血清中待測(cè)DNA拷貝數(shù)( copies/ml)，Q為PCR擴(kuò)增后計(jì)算機(jī)檢測(cè)的原始DNA拷貝數(shù)，Vdna為抽提的DNA稀釋液體積，VPCR為用于PCR擴(kuò)增的DNA體積，Vext用于抽提DNA的血清體積。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組間EBV DNA拷貝數(shù)比較采用非參數(shù)樣本Mann-Whitney rank-sum檢驗(yàn)，兩組間EBV DNA陽性率比較采用卡方檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用稀釋成不同濃度的EBV DNA陽性對(duì)照在PE7700型擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在PCR反應(yīng)過程中，每8s實(shí)時(shí)檢測(cè)一次產(chǎn)物量，反應(yīng)結(jié)束時(shí)得出PCR擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線（見圖IA）及熒光定量PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖IB)。

圖IA

圖IB

Fig. IDetection of EBV DNA by real time quantitative PCR.

(A)plot corresponds to a particular input target quantity marked by a corresponding symbol. The X axis denotes the cycle number of a quantitative PCR

reaction. The Y axis denotes the △Rn. which is the fluorescence intensity over the background.(B) plot of the threshold cycle (Ct) against the input

target quantity (common log scale). The input target quantity was expressed as copies of EBV DNA.

2.2血培養(yǎng)陰性Sepsis患者血清EBV DNA含量變化

20例血培養(yǎng)陰性Sepsis患者血清EBVDNA的檢出率為30%，中位拷貝數(shù)為2 650 copies/ml(0 -5 900 000 copies/ml).

2.3正常對(duì)照組血清EBV DNA含量變化

20例正常對(duì)照組中有0例血清中檢測(cè)到EBV DNA 0%，EBV DNA中位拷貝數(shù)為0 copy/ml(0 - 71 000 copies/ml)。

2.4血培養(yǎng)陰性Sepsis患者和正常對(duì)照組血清EBV DNA含量比較

血培養(yǎng)陰性Sepsis患者血清EBV DNA檢出率為30%，明顯高于正常對(duì)照組血清EBV DNA檢出率0%(P<0. 001. Chi-square Test)。Sepsis血培養(yǎng)陰性患者血清EBV DNA的拷貝數(shù)(中位數(shù)2 650 copies/ml)明顯高于正常對(duì)照組（中位數(shù)0 copy/ml)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，Mann-Whitney rank-sum test)。

3討論

目前，膿毒癥的病死率高達(dá)30 %～50 % ，一旦并發(fā)休克和多器官衰竭，其病死率可達(dá)80 %～90 %。膿毒癥的級(jí)聯(lián)式炎性反應(yīng)、凝血功能激活和纖溶功能受損最終可導(dǎo)致微循環(huán)障礙、多器官損傷和死亡[3]。在膿毒癥的處理中常見的問題有:未能盡早發(fā)現(xiàn)重癥患者、擴(kuò)容不足、抗生素的使用太晚或劑量不足、心功能保護(hù)不當(dāng)、血糖控制不當(dāng)、急性肺損傷時(shí)未能使用低潮氣量和低氣壓通氣，在頑固性休克時(shí)未能有效治療腎功能不全[4]。

血培養(yǎng)陽性是診斷Sepsis的重要證據(jù)之一。但是血培養(yǎng)陰性的病例在臨床上也比較多見， 通過對(duì)本次研究的20例血培養(yǎng)陰性的Sepsis患者的病史調(diào)查發(fā)現(xiàn)，血培養(yǎng)陰性容易對(duì)該疾病的診斷產(chǎn)生延誤，有研究表明：血培養(yǎng)陰性Sepsis患者的臨床表現(xiàn)(如發(fā)熱、惡心、嘔吐、脈快、頭痛，嗜睡，脫水，酸中毒)較血培養(yǎng)陽性的Sepsis患者低[5，6]。因此在血培養(yǎng)陰性的病例中及時(shí)找出病因顯得尤為重要。病毒血癥在我國(guó)比較常見，其早期癥狀和Sepsis患者比較相似，容易混淆[7]。其中以HBV隱性感染為甚，因此血培養(yǎng)陰性的Sepsis患者很可能與多種病毒感染相關(guān)。EB病毒是一種人類皰疹病毒，基因組為雙鏈DNA。世界上90%人群成年前均感染過EBV大多數(shù)正常人攜帶EBV，這種原處于靜止?fàn)顟B(tài)的病毒一旦處于活化狀態(tài)，即可變?yōu)榕c包括腫瘤在內(nèi)很多疾病相關(guān)的病因。其中EBV-DNA檢測(cè)在血培養(yǎng)陰性的Sepsis患者有一定的表達(dá)，血培養(yǎng)陰性患者中可能EBV感染并導(dǎo)致病毒血癥。 Real-time定量PCR技術(shù)是運(yùn)用熒光探針、通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測(cè)PCR擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)變化，反映PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)變化，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，具有快速、準(zhǔn)確、不易被污染等優(yōu)點(diǎn)。

本研究應(yīng)用熒光定量PCR分析血培養(yǎng)陰性膿毒血癥血清中EBV DNA含量，發(fā)現(xiàn)30%的血培養(yǎng)陰性膿毒血癥患者血清可以檢出EBV DNA，而正常對(duì)照組患者僅0%可以檢測(cè)出EBV DNA。血培養(yǎng)陰性膿毒血癥組患者血清EBV DNA含量（中位數(shù)2 650 copies/ml），顯著高于正常對(duì)照組患者的EBV DNA含量(中位數(shù)0 copy/ml)。提示血培養(yǎng)陰性Sepsis患者血清EBV DNA含量明顯升高，對(duì)治療后隨診膿毒血癥患者血清EBV DNA進(jìn)行定量檢測(cè)有助于監(jiān)測(cè)患者的預(yù)后[8，9]。

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