法尼酯X受體(FXR)在大鼠膽管損傷修復中的表達研究

摘要：目的：醫(yī)源性膽管狹窄已是老問題，但當前仍然具有重要意義，從國內(nèi)、外有關的大量文獻報道中可見一斑[1]。據(jù)美國的資料顯示，在一組160萬例的腹腔鏡膽囊切除術中，膽管（肝外）損傷率為0.5%。生理性膽管損傷的膽道自我修復過程中涉及到多種信號通路，國內(nèi)外研究證實法尼酯受體X（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）可能對此信號通路具有阻斷作用。本實驗旨在探討法尼酯X受體（FXR）在大鼠膽管損傷修復中的表達，通過大鼠膽管上皮FXR時間表達與血液中膽汁酸含量對比關系，闡明FXR在膽道修復中的作用。方法 用蛋白凝膠電泳法檢測FXR 在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管膽管組織中的表達。采用等級秩和檢驗統(tǒng)計分析；使用SPSS15.0 分析軟件包分析數(shù)據(jù)；P<0.05 為有顯著性差異。結果 FXR在大鼠損傷膽管中表達有統(tǒng)計學差異，P<0.05。FXR在膽管損傷修復的過程中呈陽性表達，膽汁酸濃度越高，F(xiàn)XR在膽管中的表達越低，而且表達強度隨損傷后的時間延長而減少。結論：FXR 可能是一個保護性受體之一，其表達上升可能是膽管損傷修復的機制的一部分。在膽道損傷中炎癥介質的釋放可能抑制了其表達，通過激活其表達有望對加速膽管損傷的修復起到一定作用。

關鍵詞：膽道損傷；法尼酯受體X；修復

【中圖分類號】R575.7 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2014）11-0011-01

醫(yī)源性膽管損傷是膽囊切除術最嚴重的并發(fā)癥，早已為人們所熟知和警惕，但仍時有發(fā)生，此外胃大部切除術、肝切除術、肝破裂修補術時也可發(fā)生。術后突出表現(xiàn)為膽道瘢痕性孿縮和膽管狹窄，膽道損傷后的過渡修復可能是其產(chǎn)生的重要原因之一，其機制尚不明確。法尼酯X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）屬于代謝性核受體的一個亞族，能調節(jié)多種FXR靶基因的表達。FXR在肝臟、腸、腎臟、腎上腺高表達，而在脂肪組織和心臟中低表達[2-3]。 作為一種關鍵的代謝調節(jié)劑，F(xiàn)XR有著比人們以往認為的更廣泛的作用。最近有越來越多的研究證明法尼酯X受體與炎癥和膽汁淤積這兩大病理過程有著密切的聯(lián)系[4-5]。本實驗的目的是通過觀察FXR在大鼠膽道損傷修復過程中的表達情況，觀察其與血清膽汁酸含量的對比關系，明確FXR在膽道損傷后膽道修復過程中的作用，從而進一步探討膽道損傷后的修復機制，為膽道損傷的正確治療及預防提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

選用健康wistar大鼠60只，雌雄不限，體重200g左右，通過手術建立膽總管導管動物模型。將大鼠隨機分為3組，一組為假手術組，一組為生理鹽水灌注組，另外一組為過氧化氫灌注組。觀察給藥后1、3、7、14天損傷及修復期的膽管中FXR的表達情況及血清中總膽汁酸的含量。所有標本采集血清后采用全自動生化分析儀測定膽汁酸含量，采用免疫電泳測定膽管上皮內(nèi)FXR蛋白免疫印跡實驗。

1.2 方法

1.2.1 實驗操作：

實驗動物稱重、麻醉：按照體重給予%戊巴比妥鈉腹腔注射，0.3ml/100g，10-15分鐘大鼠麻醉。固定，開腹：大鼠后仰臥固定于手術臺，按照無菌手術操作切開腹腔，暴露膽總管及十二指腸。假手術組僅完成開腹手術，不做插管。以穿刺法將聚乙烯塑膠導管插入膽總管管腔，另一端與預先已插置于頸部的導管栓連接，再以縫線和快干膠固定。術后逐層縫合：生理鹽水組恒速灌流15min；過氧化氫組（300umol/L）灌流15min。術后處理：術后禁食水24小時，給予青霉素G（80000U）預防感染。

1.2.2 標本收集

術后的大鼠，經(jīng)24小時喂養(yǎng)后，斷頭處死并取血5ml，開腹取膽總管。血液樣本于冰上放置10min，隨后4℃，14000rpm離心15min，取上層血清樣本于-80℃凍存。組織樣本稱重，按樣本與裂解液比例1：3-3.5w/v（重量/體積）加入裂解液。一般為150-170mg：500ul。將組織放入預冷研缽充分短時研磨，同時加入50×Cocktail蛋白酶抑制劑。收集勻漿液于冰上靜止30min，期間利用超聲振蕩器于4℃振蕩三次，超聲3-4s/次，強度為最大強度的3/4.間隔10s，至溶液透明。隨后于4℃離心20min，14000rpm。收取上清液，分裝，-80℃凍存。

1.2.3 電泳

Western Blotting：提取組織/細胞蛋白質，并測定蛋白含量。對細胞抽提液進行SDS-PAGE電泳。將蛋白質電轉移到硝酸纖維素膜上，并干燥。將硝酸纖維素膜至于平皿中，加入封閉液（脫脂奶粉），室溫輕輕震蕩2-3小時。加入I抗，4℃輕輕震蕩2小時，PBS洗3次。將膜轉入150mM NaCl， 50 mM Tris-HCl（PH7.5）的溶液中，室溫輕輕震蕩10分鐘；加入II抗，室溫輕輕震蕩1小時；取出纖維素膜，150mM NaCl， 50 mM Tris-HCl（PH7.5）溶液中洗3-5次。顯色，照像。

運用圖像分析軟件對目標條帶掃描，且分析條帶的光密度值。結果與內(nèi)參數(shù)據(jù)進行倍比處理。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

采用等級秩和檢驗統(tǒng)計分析；使用SPSS15.0 分析軟件包分析數(shù)據(jù)；P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1、膽汁酸含量結果分析

經(jīng)過統(tǒng)計學處理，提示膽道H2O2灌注造成膽道損傷，膽道中膽汁酸的濃度較假手術組及生理鹽水灌注的表達有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管組中術后1d、3d、7d、14d血清中總膽汁酸的含量（見表1，圖1）

2.2、FXR表達量結果分析

FXR在術后各期表達均較強， 無顯著性差別， 與假手術組與生理鹽水組比較，F(xiàn)XR表達存在顯著性差異（均P <0.05）。在大鼠損傷膽管、生理鹽水處理膽管及正常膽管組中術后1d、3d、7d、14d膽管中FXR表達量（見圖2）

3、討論

膽管損傷自身修復的過程涉及到多種信號通路，其中IL-6/gpl30/STAT3信號通路就是比較典型的一個，而TGF-β1是與瘢痕形成關系最密切、最具代表性的生長因子。近來有大量研究指出法尼酯X受體（FXR）與IL-6、TGF-β1、IL-1等炎性介質的表達有一定關系。這為我們解決膽道損傷后狹窄的問題提供了一個新思路。另外，已有研究表明膽汁酸激活FXR能夠促進肝臟再生，抑制肝纖維化，那么對于同樣與膽汁酸密切相關的膽道組織的損傷后修復的過程中，F(xiàn)XR的表達情況會是怎樣呢？

生理濃度的初級膽汁酸如鵝脫氧膽酸（ chenodexycholic acid， CDCA）、膽酸能與FXR在體外結合，并可募集輔活化子與FXR 配體結合域的結合；且該類配體不能與其他核受體相結合； 而其他核受體的配體對FXR的活化也沒有影響。以上證據(jù)表明膽汁酸是作為配體與FXR結合的。本實驗結果提示：FXR在膽管損傷修復的過程中呈陽性表達，膽汁酸濃度越高，F(xiàn)XR在膽管中的表達越低，而且表達強度隨損傷后的時間延長而減少。膽汁酸的濃度影響了FXR在膽管中的表達，提示膽汁酸或膽汁酸中的某一成分抑制了FXR在膽管中的表達。

另有報道提示膽汁淤積引起的的炎癥可抑制FXR的表達和活性，F(xiàn)XR或FXR調解基因的缺失可導致膽汁淤積，最后FXR激動劑可GW4060通過上調FRX可顯著減輕肝內(nèi)外膽汁淤積小鼠模型的肝損傷，減少肝內(nèi)炎癥細胞浸潤，抑制膽管增殖。本實驗通過膽道H2O2灌注造成膽道損傷，膽道中FXR的表達較假手術組及生理鹽水灌注的表達有統(tǒng)計學差異，這提示通過激活FXR的高表達，阻斷IL-6/gpl30/STAT3信號通路，可能抑制Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的合成，并加速ECM的分解，從而減輕膽管損傷后的瘢痕攣縮，減少膽道狹窄的發(fā)生。本研究提示FXR可能是一個保護性受體，在膽道損傷中膽汁酸及炎癥介質可能抑制了其表達，激活其表達有望是膽管損傷修復的新靶點。

參考文獻

[1] 黃志強.醫(yī)源性膽管損傷：老問題，新意義[J].中國實用外科雜志，1999，19（8）：451-452.

[2] 黃志強.必須重視腹腔鏡膽囊切除術的安全性[J]. 中華外科雜志，1995， 33（11）：645-646.

[3] Bishop-Bailey D， Walsh DT， Warner TD. Expression and activation of the farnesoid X receptor in the vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A 2004； 101：3668-3673

[4] Trauner M. The nuclear bile acid receptor FXR as a novel therapeutic target in cholestatic liver diseases： hype or hope？[J]. Hepatology，2004，40（1）：260-263.

[5] 陳莉萍，郭毅斌，戴睿武，等.IL-6/STAT3活化在大鼠肝移植膽管上皮細胞增殖中的作 [J].解放軍醫(yī)學雜志，2008，33（2）：155-158.等