遺傳變異與疫苗免疫、發(fā)病機(jī)理及診斷的關(guān)系（續(xù)）豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）：

上期回顧：上一期主要介紹了PCV2分離株的分子差異與PCV2的致病性，包括豬圓環(huán)病毒間致病差異、ORF1和ORF2對(duì)致病性的影響、CP內(nèi)的抗體表位、PCV2基因型間的抗原性差異。

關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：PCV2；PCV2致病機(jī)理；PCV2遺傳變異

中圖分類(lèi)號(hào)：S852 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2014）10-0070-02

注：目前國(guó)內(nèi)的洛陽(yáng)普萊柯、黑龍江的哈維科、四川的成都天邦等公司均有可預(yù)防PCV2感染的商品疫苗。

3 遺傳變異在診斷中的作用

3.1 PCV1和PCV2的鑒別診斷

PCV和PCVAD的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法已經(jīng)廣泛綜述（Gillesipe等，2009；Opriessing等，2007）。PCV1和PCV2特異性的兼并引物可以用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）或原位雜交來(lái)鑒別PCV1和PCV2（Larochelle等，1999；Ouaradni等，1999；Kim和Chae，2002）。另一個(gè)方法是PCR擴(kuò)增結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）。（Fenaux等，2000）。還有報(bào)道的是PCV1和PCV2特異性單克隆抗體，它可以用于基于抗體的實(shí)驗(yàn)，如間接免疫熒光（IFA），免疫組織化學(xué)（IHC）和抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA；Allan和Ellis，2000）。最終還有檢測(cè)PCV1和PCV2特異抗體的方法，包括IFA和ELISA（Allan和Ellis，2000；Blanchard等，2003）。

3.2 PCV2a和PCV2b的鑒別

第一個(gè)用于快速鑒別PCV2a和PCV2b的方法是RFLP圖譜（Wen等，2005；Carman等，2008）。最早在北美鑒定PCV2b基因型使用的方法就是RFLP（Carman等，2008）。該分析使用PCR擴(kuò)增包含完整ORF2的902 bp片段。PCR產(chǎn)物用XbaI、EcoRI和SmaI在獨(dú)立反應(yīng)中酶切，產(chǎn)生的422 bp目的片段鑒定為PCV2a，431 bp鑒定為PCV2b?？焖賲^(qū)分PCV2a和PCV2b基因型的方法基于PCR，使用的是ORF2中基因型特異性標(biāo)簽序列（在第三部分描述；Cheung等，2007）。然而，因?yàn)闃?biāo)簽基序中微小的序列差異，探針與基因型特異標(biāo)簽雜交經(jīng)常失敗。另一種替代性的基于TaqMan分析，由Kansas州立獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室（KSVDL）提供，該方法基于ORF1中872位單核苷酸變化。在這一位點(diǎn)PCV2a為C而PCV2b為T(mén)。即使這是在第三個(gè)密碼子單一突變，可以區(qū)分2a和2b。目前還沒(méi)有能夠區(qū)別PCV2基因型的抗體分析 方法。

4 疫苗和免疫

4.1 PCV2疫苗的有效性

第一個(gè)商業(yè)化的二劑量桿狀病毒表達(dá)CP的疫苗（Intervet）于2006年在一個(gè)小的仔豬圈進(jìn)行測(cè)試，來(lái)完成Kensas PRRSV陰性農(nóng)場(chǎng)的建設(shè)（Horlen等，2008）。該農(nóng)場(chǎng)在2005年末暴發(fā)了嚴(yán)重的PCVAD，同時(shí)群體中產(chǎn)生了PCV2b。與對(duì)照組相比，接種疫苗豬死亡率下降，病毒血癥降低。此外，免疫豬在運(yùn)送到市場(chǎng)時(shí)體重更高（圖4）。該研究證實(shí)基于PCV2a的疫苗可以在野外保護(hù)PCV2b感染。此外，這是第一個(gè)報(bào)道的可以減少增重的PCVAD。更多的野外和實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)（Fachinger等，2008；Fort等，2008，2009；Kixmoller等，2008；Martelli等，2011；Opriessin等，2008a，2011，2009）。

目前，基于表達(dá)PCV2a的ORF2抗原，有四種商業(yè)化疫苗在野外使用。Circumvent PCV和Ingelvac CircoFLEX由桿狀病毒表達(dá)PCV2的CP組成，分別為兩倍或單倍劑量使用。第三種疫苗Fostera PCV2為包含PCV1骨架，表達(dá)PCV2的ORF2的滅活全病毒。第四種Circovac將滅活全PCV2a作為抗原 *。目前沒(méi)有證據(jù)表明PCV2b的CP抗原同時(shí)使用會(huì)現(xiàn)在的疫苗提供更有效的保護(hù)。

最近實(shí)驗(yàn)室疫苗研究將外源標(biāo)簽作為陽(yáng)性篩選標(biāo)記（Beach等，2011；Huang等，2011）。這些疫苗允許鑒別免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物（DIVA）檢測(cè)方法的發(fā)展。

4.2 疫苗接種后抗病毒宿主免疫

PCVAD的一個(gè)特征是PCV2可以調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。比如，PMWS表現(xiàn)為完全喪失淋巴細(xì)胞（Chae，2004）。其它極端情況，如PDNS豬產(chǎn)生超免反應(yīng)，包括產(chǎn)生大量PCV2特異抗體，導(dǎo)致免疫復(fù)合物形成和疾病發(fā)生（Wellenberg等，2004）。

為了解PCV2調(diào)節(jié)宿主免疫的機(jī)制，我們用實(shí)驗(yàn)感染、疫苗免疫和臨床患病豬的血清，來(lái)鑒定CP識(shí)別的功能域（Trible等，2011）。疫苗免疫誘導(dǎo)的抗體識(shí)別最大的肽段CP（43～233）。相比之下PDNS豬產(chǎn)生的抗體識(shí)別最小肽段區(qū)域，其中包括一個(gè)免疫決定功能域169-STIDYFQPNNKR-180。CP（169～180）功能域位于C表位，在所有PCV2分離株中高度保守。在免疫和PCV2感染豬中還發(fā)現(xiàn)抗體反應(yīng)存在差異。雖然疫苗接種和感染豬都有相似水平的PCV2特異性抗體，但是疫苗接種會(huì)使PCV2中和活性上升4倍（圖5）。這些結(jié)果表明CP（169～180）可能作為誘餌，轉(zhuǎn)移體液免疫遠(yuǎn)離保護(hù)性表位。一個(gè)可能的解釋是抗體的可接近性和單體的免疫原性與CP的多聚體對(duì)抗。前面討論到Khayat等，（2011）解決了CP的晶體結(jié)構(gòu)，其單體形式包括一個(gè)暴露的莖環(huán)加工CP（169～180），它埋在VLP中。此外桿狀病毒表達(dá)的CP可以組裝成病毒樣顆粒（Khayat等，2011）.

實(shí)驗(yàn)性攻毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這一現(xiàn)象（文章準(zhǔn)備中）。大腸桿菌或桿狀病毒表達(dá)的CP（單體43～233位）免疫豬。免疫桿狀病毒表達(dá)蛋白誘導(dǎo)高水平的抗CP（43～233）抗體和低水平的抗CP抗體（169～180）。PCV2攻毒后，免疫桿狀病毒表達(dá)的VLP組血清中檢測(cè)不到病毒。免疫CP（43～233）單體可以誘導(dǎo)高水平的抗CP（43～233）和對(duì)CP（160～180）的高反應(yīng)性。CP單體免疫豬的病毒血癥與未免疫PCV2攻毒株相似（未顯示數(shù)據(jù)）圖6。我們提出保護(hù)性抗體來(lái)自PCV2 VLP形成的表位，CP單體表位產(chǎn)生非保護(hù)性抗體。針對(duì)卷曲表位的抗體在PCVAD的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因?yàn)榫砬贵w在所有PCV2分離株中高度保守，該模型預(yù)測(cè)PCV2a和PCV2b引起的疾病應(yīng)該沒(méi)有差異。

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（未完，待續(xù)）