霉菌毒素吸附劑效果評(píng)估的研究

摘 要：大量的研究結(jié)果表明，飼料及其原料中不可避免的存在霉菌毒素污染。霉菌毒素已經(jīng)對(duì)畜牧業(yè)和人類健康造成嚴(yán)重危害，目前最有效、最常用的控制霉菌毒素的方法是在飼料或飼料原料中添加霉菌毒素吸附劑，然而，并非所有的霉菌毒素吸附劑產(chǎn)品都接受了充分的檢驗(yàn)。因此，迫切需要用科學(xué)的方法來(lái)評(píng)價(jià)霉菌毒素吸附劑。本文將對(duì)霉菌毒素吸附劑的種類及霉菌毒素吸附劑的效果評(píng)價(jià)方法進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：霉菌毒素；吸附劑；效果評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S816 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2014）10-0066-02

霉菌毒素是霉菌的代謝次生物，普遍存在于飼料及其原料中。目前已知污染飼料的霉菌毒素約有100多種，主要為青霉菌屬、曲霉菌屬和鐮刀菌屬所產(chǎn)的多種霉菌毒素（計(jì)成，2007），其中對(duì)畜禽危害較大的主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、煙曲霉毒素、單端孢毒素和玉米赤霉烯酮等。世界上至少有25 %的谷物受到霉菌毒素的污染，對(duì)飼料業(yè)、畜牧業(yè)和人類健康造成嚴(yán)重危害。

國(guó)內(nèi)外許多研究者對(duì)如何消除霉菌毒素對(duì)畜禽健康和生產(chǎn)性能的不良影響、降低霉菌毒素及其代謝產(chǎn)物在畜產(chǎn)品中的殘留、保證畜產(chǎn)品安全等方面作了大量研究。在生產(chǎn)實(shí)踐中，霉菌無(wú)法完全消除。使用防霉劑雖可有效防止飼料霉變，但不能降低已存在于飼料中的霉菌毒素含量（王若軍，2003），且膨化制粒等處理工藝也并不能達(dá)到降解霉菌毒素的目的。從技術(shù)角度考慮，目前不可能存在真正意義上的霉菌毒素降解劑或裂解劑。鑒于此，飼料中添加霉菌毒素吸附劑是降低霉菌毒素危害、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的有效手段。目前，市場(chǎng)上的霉菌毒素吸附劑有活性炭、鋁硅酸鹽類、有機(jī)物類（如酵母細(xì)胞壁等）及其它樹脂類（如消膽胺等），主要以黏土類（氫氧化硅鋁酸鈉鈣，HSCAS）和寡聚糖類（酵母細(xì)胞提取物）為基礎(chǔ)，通過(guò)采用不同加工工藝處理，以增強(qiáng)產(chǎn)品對(duì)各種霉菌毒素的吸附能力。但歸根結(jié)底，黏土類仍然以吸附黃曲霉毒素為主，而寡聚糖類主要對(duì)嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮吸附效果較為明顯。

雖然霉菌毒素對(duì)畜牧生產(chǎn)危害甚大，但國(guó)內(nèi)有關(guān)體外快速霉菌毒素吸附劑的相關(guān)研究報(bào)道很少，而且主要局限于黃曲霉毒素B1（葉盛群，2012）。本文收集一些對(duì)霉菌毒素吸附劑的相關(guān)評(píng)估方法如下：

1 體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

因?yàn)轶w內(nèi)實(shí)驗(yàn)成本高，工作量大，在進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前，人們往往用體外實(shí)驗(yàn)證明吸附劑的吸附效果，體外試驗(yàn)在證明一種吸附劑對(duì)某種毒素不具有吸附力上很有用。如果一種物質(zhì)在體外不能吸附某種毒素，那么很可能在體內(nèi)也是如此。如果想評(píng)價(jià)多種不同來(lái)源的樣品作為吸附劑的可能性，體外試驗(yàn)作為第一步檢驗(yàn)是非常有價(jià)值的。

馬學(xué)會(huì)（2011）在pH 3.0檸檬酸緩沖液和pH 6.5磷酸氫鈉緩沖液配制霉菌毒素反應(yīng)液，反應(yīng)液中霉菌毒素含量：200 μg/L黃曲霉毒素B1、2 mg/L玉米赤霉烯酮、50 mg/L嘔吐毒素、200 μg/L赭曲霉素、2 mg/L煙曲霉毒素Bl。吸附試驗(yàn)原理：試管中稱取一定量的吸附劑樣品，加入[按0.1 %（w/v）比例]預(yù)先已配制的反應(yīng)液（含有所要求的標(biāo)準(zhǔn)霉菌毒素濃度），37 ℃下震動(dòng)培養(yǎng)1.5 h后離心。取離心后的上層清液，用高效液相色譜儀測(cè)定其中所含不同霉菌毒素的濃度，從而計(jì)算出吸附劑產(chǎn)品的吸附率。吸附試驗(yàn)步驟：（1）分別在不同吸附劑樣品中加入10 mL霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，并預(yù)留2支試管用于霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)緩沖液空白組（不含吸附劑）；（2）將試管在37 ℃水浴恒溫振蕩器中震蕩1.5 h，震蕩過(guò)程中確定試管被固定；（3）用離心機(jī)在2 000 rpm/min下離心10 min后，小心移取上清液200 μL（避免下層混濁物帶入上述液體），然后加入5 mL流動(dòng)相，混合均勻后裝入進(jìn)樣瓶，取樣100 μL，通過(guò)高壓液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析。

1.1 ELISA法吸附

稱取50 mg霉菌毒素吸附劑樣品于試管中，加入 10 mL pH3.0霉菌毒素工作液，體系中霉菌毒素吸附劑的添加量為5 mg/mL?？瞻讓?duì)照為不添加任何霉菌毒素吸附劑的 10 mL pH3.0霉菌毒素工作液。將試管放在37 ℃恒溫振蕩器上，震蕩1 h。反應(yīng)結(jié)束后于3 500 r/min離心10 min，測(cè)定上清液中的霉菌毒素含量。

1.2 解吸附試驗(yàn)

上述試驗(yàn)結(jié)束后，傾去離心管中上清液，在剩余物中加入10 mL pH6.8磷酸鹽緩沖液，37 ℃恒溫震蕩1 h。反應(yīng)結(jié)束后于3 500 r/min離心10 min，測(cè)定上清液中剩余的霉菌毒素含量。數(shù)據(jù)處理：根據(jù)檢測(cè)毒素的含量，按下列公式計(jì)算霉菌毒素吸附劑的吸附效率。

Y=100×（A-B-C）/A

上式中：Y表示霉菌毒素吸附劑對(duì)霉菌毒素的吸附效率；A表示空白對(duì)照組（即霉菌毒素工作液中不加吸附劑）含量；B表示吸附試驗(yàn)中上清液中霉菌毒素的含量；C表示解吸附試驗(yàn)中上清液中霉菌毒素的含量。

涂威（2011）等報(bào)道，體外方法能直觀評(píng)價(jià)吸附劑對(duì)霉菌毒素的吸附性能，作為一個(gè)初步評(píng)價(jià)手段，主要起到“篩選”吸附劑的作用。通常按照下列步驟進(jìn)行：

（1）吸附試驗(yàn)：① 配制一定量的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入待測(cè)的一定量的吸附劑；② 設(shè)定溶液pH和溫度，搖床振蕩一定時(shí)間，然后在一定轉(zhuǎn)速下離心；③ 高效液相色譜法測(cè)定上清液中霉菌毒素的含量。同時(shí)設(shè)置未添加吸附劑的對(duì)照組以消除試驗(yàn)過(guò)程中霉菌毒素的非特異性吸附，按照實(shí)驗(yàn)需要每個(gè)對(duì)照組設(shè)置多個(gè)重復(fù)。按下式計(jì)算吸附量q（ng/mg）和吸附率Y（%）：

q=V（Co-C）/m （1）

Y=100（Co-C）/Co （2）

其中：v—溶液的體積（mL）；m—吸附劑的用量（mg）：CO、C—吸附前后霉菌毒素的濃度（ng/mL）。

（2）解吸試驗(yàn)：吸附反應(yīng)結(jié)束后，傾去離心管上清液，殘余物中加入一定量的水溶液，搖床振蕩解吸，然后在一定轉(zhuǎn)速下離心（水溶液pH，溫度，搖床振蕩時(shí)間，離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間與吸附實(shí)驗(yàn)相同）高效液相色譜法測(cè)定上清液中霉菌毒素的含量，經(jīng)殘液校正后，計(jì)算解吸量及解吸率。通常吸附率越高，解吸率越低的吸附劑應(yīng)用前景最好。在驗(yàn)證某種吸附劑的最佳吸附條件時(shí)，我們還應(yīng)設(shè)置不同的振蕩時(shí)間，不同的吸附劑用量，溫度、pH梯度等。

2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

體外試驗(yàn)不能完全模擬動(dòng)物體內(nèi)具有復(fù)雜酶活性、pH 值劇烈波動(dòng)等特點(diǎn)的消化道環(huán)境。不能充分說(shuō)明吸附劑對(duì)霉菌毒素的結(jié)合效果，需要與動(dòng)物試驗(yàn)相結(jié)合，更合理的評(píng)價(jià)吸附劑的安全性和作用效果。因此在經(jīng)過(guò)體外實(shí)驗(yàn)后，對(duì)有希望的樣品必須進(jìn)一步用體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

首先進(jìn)行飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，為了確證一種吸附劑的有效性，以下4種試驗(yàn)處理是必不可少的：

① 日糧1：對(duì)照日糧，不含霉菌毒素和吸附劑；

② 日糧2：含有霉菌毒素的日糧1；

③ 日糧3：含有吸附劑的日糧1；

④ 日糧4：含有吸附劑的日糧2（含有霉菌毒素）。霉菌毒素的作用之一是降低動(dòng)物采食量，抑制動(dòng)物生長(zhǎng)。霉菌毒素能降低某些消化酶類的活性，使一些營(yíng)養(yǎng)成分的吸收受阻，影響動(dòng)物生長(zhǎng)。

因此，我們可以通過(guò)測(cè)定動(dòng)物的生理生化指標(biāo)來(lái)說(shuō)明吸附劑對(duì)霉菌毒素的吸附程度，最常見(jiàn)的測(cè)定指標(biāo)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的日增重（ADG）、采食量（FI）和料重比（F/G），為了對(duì)霉菌毒素吸附劑作出更深入的評(píng)價(jià)，我們還應(yīng)測(cè)定其他生理生化指標(biāo)：器官相對(duì)重量、免疫器官指數(shù)、血清、器官和組織中霉菌毒素的殘留量、血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、尿酸（UA）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、淀粉酶（AMY）、堿性磷酸酶（ALP）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）。這些指標(biāo)可用試劑盒通過(guò)全自動(dòng)（或半自動(dòng)）生化分析儀測(cè)定。如果吸附劑對(duì)霉菌毒素的吸附效果良好，那么這些生理生化指標(biāo)也趨近于正常值。

3 霉菌毒素吸附劑對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響

不同霉菌毒素的分子結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)，從這種意義上來(lái)說(shuō)，它們與維生素相似，而不同于結(jié)構(gòu)都相似的蛋白質(zhì)。因此，可以假定霉菌毒素吸附劑在吸附霉菌毒素的同時(shí)，可能與飼料中的約40多種維生素、微量元素、礦物質(zhì)、必需氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分或藥劑的一種或幾種結(jié)合，干擾營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及藥物的利用。谷巍等（2010）研究表明，霉菌毒素吸附劑具有對(duì)維生素的非選擇性吸附和被維生素所飽和而喪失對(duì)毒素的吸附能力。所以在鑒別一種吸附劑是否適用時(shí)，必須考慮它對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分及藥物的影響。在鑒定霉菌毒素吸附劑對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分及藥物的吸附時(shí)，我們要針對(duì)每一種吸附劑進(jìn)行吸附試驗(yàn)和解吸試驗(yàn)。在試驗(yàn)的同時(shí)我們可以根據(jù)實(shí)際需要設(shè)置相應(yīng)的溫度，pH梯度。通過(guò)對(duì)吸附試驗(yàn)和解吸試驗(yàn)結(jié)果的分析我們可以得出吸附劑對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物的吸附能力。如果某種吸附劑對(duì)飼料中有效成分的吸附強(qiáng)而解吸少，在實(shí)際應(yīng)用中我們應(yīng)盡可能的減少其在飼料中的添加量。該吸附劑的添加將使飼料營(yíng)養(yǎng)有效性降低，所以應(yīng)考慮各種營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充平衡問(wèn)題。

4 小結(jié)

結(jié)果表明，消除霉菌毒素污染最實(shí)際、有效的方法是在飼料中添加吸附劑，吸附劑在體內(nèi)結(jié)合霉菌毒素形成復(fù)合物，使毒素經(jīng)過(guò)消化道時(shí)不被吸收，直接隨著吸附劑排出體外。對(duì)其吸附能力和吸附特異性的研究證實(shí)，這些吸附劑能不同程度的清除霉菌毒素。然而，在使用過(guò)程中均存在一定缺陷，主要是：（1）吸附功能單一，不能同時(shí)吸附飼料中存在的多種不同類型的霉菌毒素；（2）添加量大，占用過(guò)大配方空問(wèn)；（3）吸附霉菌毒素的同時(shí)，與飼料中的維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分結(jié)合，干擾營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用；（4）可能含有二噁英和其他污染物，在一定程度上污染飼料。存在的這些缺陷都是評(píng)定霉菌毒素吸附劑有效性的依據(jù)。

影響霉菌毒素吸附劑效果的因素有很多，如：吸附劑本身的結(jié)構(gòu)和特性，霉菌毒素的分子結(jié)構(gòu)及其理化特性，飼料原料的霉變程度，吸附劑的添加量、實(shí)驗(yàn)方法以及霉菌毒素的檢測(cè)方法等。因此不同霉菌毒素吸附劑對(duì)同一霉菌毒素的吸附效率不同，霉菌毒素吸附劑的晶體結(jié)構(gòu)和物理特性，包括總電荷量、電荷的分布、空隙的大小以及比表面積，是影響吸附效果的主要原因之一。同一霉菌毒素吸附劑對(duì)不同的霉菌毒素的吸附效率也不同，不同種類的霉菌毒素由于其分子大小、分子結(jié)構(gòu)以及分子極性等理化性質(zhì)的不同，從而導(dǎo)致同一種霉菌毒素吸附劑對(duì)不同的霉菌毒素吸附效率不同。如：黃曲霉毒素B1分子量312，其結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)雙呋喃環(huán)和1個(gè)氧雜萘鄰?fù)?，二呋喃環(huán)的末端有雙鍵者，是一種極性很強(qiáng)的分子。玉米赤霉烯酮分子量318，其結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)酚羥基的內(nèi)酯，溶于水，只有在堿性溶液中酯鍵才能打開，從而是一種雙極性或弱極性的分子。因此導(dǎo)致同一種霉菌毒素吸附劑對(duì)黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的吸附效率不同?？刂泼咕舅刈詈?jiǎn)便易行的方法是添加吸附劑，但從現(xiàn)有的研究來(lái)看，不同霉菌毒素分子的理化性質(zhì)差異較大，而且針對(duì)不同霉菌毒素的吸附劑種類繁多。為了降低霉菌毒素對(duì)動(dòng)物和人類造成的危害，除了對(duì)霉菌毒素吸附劑進(jìn)行研究外，建立一種快速、靈敏、易行的效果評(píng)價(jià)方法是飼料業(yè)對(duì)霉菌毒素吸附劑制定標(biāo)準(zhǔn)以及確保飼料安全的重要途徑?！酢?/p>

參考文獻(xiàn)：（6篇，略）