卷曲乳桿菌與植物乳桿菌共同對白假絲酵母菌抑制作用的體外研究

李曉翠,白會會,杜夢瑤,趙曉雯,范琳媛,尚 翔,劉朝暉

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院,北京 100026;2.北京市石景山醫(yī)院,北京 100043)

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是女性常見陰道炎性疾病之一,以陰道疼痛、刺激、外陰灼熱、性交困難及排尿困難為主要癥狀。75%的女性一生中至少會發(fā)生一次VVC[1]。在假絲酵母菌屬中,白假絲酵母菌(C.albicans)約占90%,若其長期未被抑制,極可能產(chǎn)生耐藥性[2]?，F(xiàn)VVC的治療仍以抗真菌藥物為主,但在短時間內(nèi)殺滅致病菌的同時也破壞了陰道正常菌群,這也是女性生殖道感染治療效果不佳、復(fù)發(fā)率高的關(guān)鍵。而乳桿菌作為內(nèi)源性防御機制,有研究表明乳桿菌可調(diào)節(jié)宿主免疫,恢復(fù)正常陰道菌群和干擾病原體定植[3]。通過陰道內(nèi)置入乳桿菌活菌膠囊,可有效補充陰道所需的乳桿菌,以此改善陰道菌群環(huán)境,確保陰道微生物之間的制約、平衡關(guān)系,進(jìn)而抑制假絲酵母菌,降低疾病發(fā)生及復(fù)發(fā)率。因此,重視患者陰道菌群的調(diào)節(jié)、改善陰道微生態(tài)環(huán)境,可提高疾病治療效果。目前國內(nèi)臨床可用的陰道乳桿菌為德氏乳桿菌,并非陰道優(yōu)勢菌株。研究表明,乳桿菌占優(yōu)勢的陰道菌群中,71.3%均為乳桿菌屬,其中卷曲乳桿菌比例最高,占37.0%,惰性乳桿菌占26.1%,詹氏乳桿菌占4.23%,格氏乳桿菌占4.23%[4]。Er等研究顯示,在對白假絲酵母菌的抑制作用上,卷曲乳桿菌相比其他乳桿菌并不占優(yōu)勢[5]。近期國外有學(xué)者將卷曲乳桿菌制成口服及陰道膠囊,VVC組口服及陰道應(yīng)用卷曲乳桿菌,在改善患者分泌物量及瘙癢癥狀上均有顯著作用[6]。國內(nèi)現(xiàn)未見擬將卷曲乳桿菌應(yīng)用于臨床的研究。近年植物乳桿菌對白假絲酵母菌的抑制及預(yù)防復(fù)發(fā)方面的作用得到了越來多的肯定[7-9],但植物乳桿菌在陰道微生物中含量并不多,若大量使用是否干擾陰道菌群的平衡,尚沒有明確結(jié)論。本研究旨在將卷曲乳桿菌與植物乳桿菌共培養(yǎng),在適當(dāng)增加植物乳桿菌的同時補充了卷曲乳桿菌,以探求得到更多陰道應(yīng)用乳桿菌的方法,以期為后續(xù)乳桿菌藥物研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科門診就診的VVC患者已鑒定的白假絲酵母菌菌株共10株。質(zhì)控白假絲酵母菌ATCC 5314由北京大學(xué)第一醫(yī)院皮科實驗室贈送。卷曲乳桿菌A、卷曲乳桿菌B、植物乳桿菌C各1株。選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診的微生態(tài)正?；颊叩年幍婪置谖?通過分離純化及16s-DNA鑒定共得到16株卷曲乳桿菌臨床株、4株植物乳桿菌臨床株,并對16株卷曲乳桿菌進(jìn)行抑菌能力實驗及成膜能力實驗選出抑制真菌能力最好的一株卷曲乳桿菌,即乳桿菌A,選出成膜能力最好的一株卷曲乳桿菌,即乳桿菌B,隨機選取一株植物乳桿菌,即乳桿菌C。MRS肉湯培養(yǎng)基,購自索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 乳桿菌菌懸液制備 將卷曲乳桿菌A、B及植物乳桿菌C分別接種至MRS培養(yǎng)基,置37℃ CO2孵箱培養(yǎng)24h。挑取直徑約1mm的乳桿菌菌落3～5個,懸浮于2mL無菌MRS肉湯溶液,調(diào)整其濁度達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn),使其濃度為1.5×108cfu/mL,備用。

1.2.2 質(zhì)控白假絲酵母菌(ATCC5314)菌懸液制備 將白假絲酵母ATCC 5314接種至沙保羅培養(yǎng)基,真菌孵育溫箱36℃培養(yǎng),24h挑取直徑約1mm的菌落3～5個,懸浮于2mL無菌MRS肉湯溶液中制備成0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn),使其濃度為1.0×106cfu/mL,備用。

1.2.3 96孔板制備 在96孔板第1孔分別加200μL乳桿菌A、B、C,及A、B分別與C(1∶1混合)的菌懸液,其余2～12孔加100μL MRS肉湯,倍比稀釋至10孔后,棄100μL混合液。

1.2.4 乳桿菌和白假絲酵母菌ATCC5314共培養(yǎng) 取100μL ATCC 5314菌懸液稀釋2000、5000、15000、25000、35000倍分別加至1～10孔,11～12孔分別加100μL ATCC 5314、乳桿菌懸液作為陽性、陰性對照,13孔加200μL MRS肉湯作為空白對照,將96孔板放入CO2孵箱混合培養(yǎng)24h。

1.2.5 點種培養(yǎng)基 將96孔板每孔混勻后菌懸液吸出10μL,懸空法滴至沙保羅培養(yǎng)皿,置真菌孵育溫箱(36℃)培育24h,肉眼觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況,以獨立菌落數(shù)<10個判定為抑菌孔位,并根據(jù)抑菌孔位對應(yīng)的乳桿菌濃度換算出最小抑菌濃度(圖1)。

圖1 質(zhì)控白假絲酵母菌ATCC5314與乳桿菌共培養(yǎng)后菌落生長情況

1.2.6 白假絲酵母菌實驗濃度確定 根據(jù)乳桿菌與質(zhì)控白假絲酵母菌(ATCC5314)共培養(yǎng)點種后的抑菌孔位位置,選擇既便于比較,能盡量減少對白假絲酵母菌稀釋過大后造成的誤差,最后選定將后續(xù)試驗中的白假絲酵母菌濃度定為500cfu/mL。

1.2.7 乳桿菌對10株白假絲酵母菌臨床株的抑菌實驗 重復(fù)對質(zhì)控白假絲酵母菌(ATCC5314)抑菌實驗的步驟(1.2.1至1.2.5),判讀抑菌孔位,并根據(jù)抑菌孔位對應(yīng)的乳桿菌濃度,得到相應(yīng)乳桿菌對實驗濃度的白假絲酵母菌的最小抑菌濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件,計量資料采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳桿菌對白假絲酵母菌的抑制效果 以乳桿菌對6號白假絲酵母菌500cfu/mL濃度的抑制效果為例,換算得到乳桿菌對實驗濃度的白假絲酵母菌的最小抑菌濃度(若濃度最大的1孔仍未出現(xiàn)抑制效果,記最小抑菌濃度>1.5×108cfu/mL)。見圖2。

圖2 乳桿菌A、B、C,A+C,B+C對6號白假絲酵母菌500cfu/mL濃度的抑制效果

2.2 乳桿菌對白假絲酵母菌抑制的最小抑制濃度 卷曲乳桿菌A、B即使為0.5麥?zhǔn)细邼舛葘υ囼灊舛?500cfu/mL)的白假絲酵母菌也無明顯抑制效果,乳桿菌C及混合后的菌液對試驗濃度的白假絲酵母菌的抑制效果較好。見表1。

表1 不同乳桿菌對10株白假絲酵母菌的最小抑制濃(×106cfu/mL)

2.3 卷曲乳桿菌A、B、植物乳桿菌C、混合菌A+C(1∶1)、混合菌B+C(1∶1)對白假絲酵母菌的抑制作用 五組的秩和檢驗P<0.001,表明五組間至少兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。多重比較示(表3),單一卷曲乳桿菌A與B對白假絲酵母菌的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.999);植物乳桿菌C對試驗濃度白假絲酵母菌的抑制作用明顯優(yōu)于卷曲乳桿菌A或B(P均<0.001);乳桿菌A+C(1∶1)與B+C(1∶1)對白假絲酵母菌的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.999);乳桿菌A+C(1∶1)與乳桿菌A(P<0.001)、B(P<0.001)、C(P=0.016)對白假絲酵母菌間的抑制作用有統(tǒng)計學(xué)意義,乳桿菌B+C(1∶1)與乳桿菌A(P<0.001)、B(P<0.001)、C(P=0.018)對白假絲酵母菌間的抑制作用有統(tǒng)計學(xué)意義。表明混合乳桿菌菌對白假絲酵母菌的抑制作用明顯優(yōu)于單一乳桿菌。

表2 不同乳桿菌對白假絲酵母菌抑制作用的比較

表3 不同乳桿菌對白假絲酵母菌抑制作用的多重比較

3 討 論

VVC的病原菌是以白假絲酵母菌為主的酵母菌,可分為單純性VVC和復(fù)雜性VVC[10]。乳桿菌在調(diào)節(jié)陰道微生態(tài)平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,而幾乎所有的生殖道感染都伴隨著女性陰道微環(huán)境的改變(如優(yōu)勢菌乳桿菌的減少或消失)[11]。目前對于VVC的治療僅關(guān)注于使用抗真菌類藥物,而未注意恢復(fù)陰道微生態(tài),易引起陰道菌群失衡,導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)而誘發(fā)二次感染[3]。我國近期發(fā)表的《陰道用乳桿菌活菌膠囊臨床應(yīng)用中國專家共識》也推薦陰道用乳桿菌活菌膠囊與抗真菌藥物結(jié)合治療VVC,以提高療效,減輕VVC癥狀,降低復(fù)發(fā)率。同時推薦應(yīng)用陰道用乳桿菌活菌膠囊對復(fù)發(fā)性VVC進(jìn)行鞏固治療,降低復(fù)發(fā)率,改善預(yù)后[12]?？梢娫赩VC的治療上,由單純“殺滅致病菌”轉(zhuǎn)向“殺滅致病菌并促進(jìn)益生菌生長”的理念已被廣大臨床工作者推行。目前國內(nèi)可供臨床使用的乳桿菌種類極少,如何進(jìn)一步找到更多安全、可靠、更利于陰道微生態(tài)平衡恢復(fù)的乳桿菌,成為了目前急需解決的問題。

本試驗選取的卷曲、植物乳桿菌及白假絲酵母菌均是從健康女性及VVC女性陰道分離提取純化鑒定,同源性更具有優(yōu)勢。本研究結(jié)果提示,單一卷曲乳桿菌A、B對實驗濃度的白假絲酵母菌的抑制尚不明顯。本團(tuán)隊前期試驗結(jié)果表明,將白假絲酵母菌的實驗濃度大幅度稀釋,即白假絲酵母菌稀釋至40cfu/mL時,抑制真菌作用較強的卷曲乳桿菌A才能表現(xiàn)出抑制效果,而其它卷曲乳桿菌的抑制作用需進(jìn)一步降低白假絲酵母菌的濃度才能顯現(xiàn)。這與Er等研究結(jié)果相似,即卷曲乳桿菌單獨應(yīng)用對白假絲酵母菌的抑制作用并不明顯。但單獨使用植物乳桿菌C時,可看到對隨機選定的10株白假絲酵母菌(實驗濃度)的大多數(shù)產(chǎn)生了明顯的抑制效果。更重要的是,卷曲乳桿菌(無論是A還是B)與植物乳桿菌混合后,對白假絲酵母菌的抑制作用明顯提高,超過任一菌單獨作用的效果,即相同濃度的混合乳桿菌能達(dá)到更好的抑制真菌效果,或較少的乳桿菌用量,即可達(dá)到相同的抑制真菌效果,減少了高劑量應(yīng)用時的潛在風(fēng)險,也為后期研究提供了新的思路。

研究表明,并非所有乳酸桿菌屬都有有益的作用[13]。有學(xué)者通過研究豬乳桿菌在VVC發(fā)病機制中的作用,發(fā)現(xiàn)以內(nèi)鏈球菌為主的陰道微生物組不僅可能導(dǎo)致VVC的發(fā)作,而且還會增加RVVC發(fā)生的可能性[14]。故乳桿菌的臨床應(yīng)用,不能以單一的抑制真菌作用高低來判斷,還需根據(jù)其產(chǎn)乳酸特性、產(chǎn)過氧化氫特性、黏附性及其與上皮細(xì)胞作用后是否損害上皮細(xì)胞、對微生態(tài)平衡的干擾等多方面綜合考慮。有研究提出,在人類上皮定植中應(yīng)用來自其他生物來源的不同乳酸桿菌可增加剩余共生微生物群的益生菌活性[15-17]。故今后還需就乳桿菌的其他特性做進(jìn)一步研究,包括混合菌的比例,或?qū)旌先闂U菌與抗真菌藥物分別使用或聯(lián)合使用的效果做出對比,或可否將其他生物來源的乳桿菌應(yīng)用臨床等多方面進(jìn)行研究。

總之,陰道生態(tài)系統(tǒng)的破壞可導(dǎo)致復(fù)雜性陰道感染的病原體(包括VVC)的過度生長。體內(nèi)體外研究表明,乳桿菌屬對VVC的預(yù)防和(或)治療有益。但目前可應(yīng)用于臨床,尤其國內(nèi)臨床的藥物稀缺,種類較單一,對不同種類乳桿菌的作用仍缺乏更深入的研究。本研究旨在對不同乳桿菌單獨及聯(lián)合應(yīng)用對白假絲酵母菌的抑制作用進(jìn)行比較,以期為臨床及其基礎(chǔ)研究提供一個新思路。對可應(yīng)用于臨床的乳桿菌的選擇,乳桿菌與白假絲酵母菌之間復(fù)雜的相互作用,仍需在今后工作中逐步鉆研,逐步探究。