健脾化瘀方改善晚期胃癌血液高凝狀態(tài)的作用機(jī)制研究

凌博凡, 江羽琪, 侯 茜, 施 錚, 金志超

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科, 江蘇 南京, 210029; 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 南京, 210023; 3. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科, 江蘇 南京, 210009; 4. 南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥文獻(xiàn)研究所, 江蘇 南京, 210023)

研究[1-2]表明，惡性腫瘤患者血液高凝狀態(tài)發(fā)生率約90.0%, 血栓栓塞發(fā)生率8.0%～19.0%, 在晚期胃癌中這2項(xiàng)數(shù)據(jù)分別為84.4%、13.0%[3]。靜脈血栓栓塞(VTE)已成為造成腫瘤患者死亡的第2位原因[4-5]。腫瘤血液高凝狀態(tài)的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，包括腫瘤相關(guān)慢性炎癥的促凝作用[6-8], 組織因子(TF)本身及其所介導(dǎo)的促凝途徑，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的促內(nèi)皮細(xì)胞活化作用[9-10], 以及血小板增多及活化等，各途徑之間還會相互刺激、相互促進(jìn)，造成惡性循環(huán)。晚期胃癌(Ⅲ～Ⅳ期)血液高凝狀態(tài)患者中“脾胃虛弱、氣虛血瘀證”最為多見[11-14], 因此臨床上常選用健脾益氣、活血化瘀法進(jìn)行治療。健脾化瘀方是本院腫瘤內(nèi)科常用驗(yàn)方，方中太子參、白術(shù)、淮山藥、黃芪、茯苓、薏苡仁益氣扶正，丹參、三棱、莪術(shù)、三七活血化瘀，可顧護(hù)脾胃之氣，扶助正氣，提高免疫，佐以活血化瘀、清熱解毒之藥，較單純活血化瘀的療效更佳。本研究探討健脾化瘀方治療Ⅲ～Ⅳ期胃癌合并血液高凝狀態(tài)患者的有效性與安全性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本試驗(yàn)獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批件號2020NL-087-03)，并在中國臨床試驗(yàn)注冊中心注冊(注冊號ChiCTR2000034942), 所有患者均簽署知情同意書。根據(jù)以往試驗(yàn)并查閱文獻(xiàn)，預(yù)估試驗(yàn)組有效率為66%, 對照組有效率為25%, 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，取單側(cè)α=0.025, β=0.20, 設(shè)非劣效性界值δ=0.10, 試驗(yàn)組與對照組按1∶1分配，估算出每組病例數(shù)應(yīng)為22例。2020年1月—2020年12月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)腫瘤內(nèi)科采用隨機(jī)數(shù)字表法，并用區(qū)組隨機(jī)的方法，將受試者按照1∶1的比例隨機(jī)分組，共入組符合標(biāo)準(zhǔn)患者50例(試驗(yàn)組25例，對照組25例)。最終試驗(yàn)組脫落3例，對照組脫落1例，共完成患者46例(試驗(yàn)組22例，對照組24例)。2組患者入組時(shí)年齡(P=0.123)、性別(P=0.747)、病程分期(P=0.333)的差異均為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 胃癌的診斷與分期標(biāo)準(zhǔn): ① 胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(WS16-2010)中“胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)”[15]。② 胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)參照2016年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(UICC/AJCC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第8版)[16]。

1.2.2 晚期胃癌血液高凝狀態(tài)診斷標(biāo)準(zhǔn): 參照第7屆全國血栓與止血學(xué)術(shù)會議所擬“前DIC(Pre-DIC)診斷參考標(biāo)準(zhǔn)”。滿足以下2項(xiàng)或以上者，可診斷血液高凝: ① D-二聚體(D-D)>0.5 mg/L; ② 纖維蛋白原(FIB)>4 g/L; ③ 活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)縮短>3 s; ④ 凝血酶時(shí)間(TT)縮短>3 s; ⑤ 血小板(PLT)>300×109/L。

1.2.4 納入標(biāo)準(zhǔn): ① 病理確診為胃癌者; ② 符合晚期胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)者，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期; ③ 符合本研究所擬定的血液高凝狀態(tài)診斷標(biāo)準(zhǔn)者; ④ 符合“血瘀證”合并“脾胃虛弱證”標(biāo)準(zhǔn)者; ⑤ 年齡18～80歲者; ⑥ 體力狀況評分(KPS評分)≥60分者; ⑦ 預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月者; ⑧ 入組前2周內(nèi)未行止血、溶栓、抗凝、抗血小板、非甾體類抗炎藥或中藥活血化瘀治療者; ⑨ 自愿接受本試驗(yàn)研究，并根據(jù)藥品臨床試驗(yàn)管理規(guī)范(GCP)要求簽署知情同意書。

1.2.5 排除標(biāo)準(zhǔn): ① 消化道梗阻、空腸造口等不能口服藥物的患者; ② 有癥狀的腦轉(zhuǎn)移或精神障礙患者; ③ 患有嚴(yán)重心血管疾病、慢性肝病、腎病、血液病的患者; ④ 有活動性出血或有出血傾向者; ⑤ 患有嚴(yán)重不可控制的醫(yī)學(xué)疾病或急性感染的患者; ⑥ 實(shí)驗(yàn)室檢查異常者，血常規(guī)中性粒細(xì)胞(ANC)<2.0×109/L, 血紅蛋白(Hb)<90 g/L, PLT<80×109/L; 肝功能總膽紅素(TBil)>1.5倍正常上限，谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)>1.5倍正常上限; 腎功能內(nèi)生肌酐清除率(CCr)<50 mL/min, Cr>1.5倍正常上限; ⑦ 孕婦、哺乳期患者; ⑧ 藥物濫用或臨床、心理和社會特征干擾研究和知情同意的患者。

1.3 治療方法

試驗(yàn)組與對照組患者均接受腫瘤基礎(chǔ)治療(正?；熂皩ΠY支持治療)，試驗(yàn)組患者治療同時(shí)還口服健脾化瘀方(黨參30 g, 黃芪15 g, 炒白術(shù)15 g, 薏苡仁30 g, 茯苓10 g, 半枝蓮15 g, 重樓9 g, 三棱10 g, 莪術(shù)10 g, 丹參10 g, 三七10 g, 蛇舌草15 g, 菝葜15 g), 1劑/次, 2次/d, 口服21 d為1個(gè)周期，服用2個(gè)周期，共計(jì)(42±2) d。臨床試驗(yàn)期間，除接受腫瘤基礎(chǔ)治療外，不得加用改善高凝狀態(tài)和影響炎癥反應(yīng)的藥物。

1.4 觀測指標(biāo)

2組病例均觀察(42±2) d, 時(shí)間點(diǎn)為基線(第1天)、訪視2[第(21±2)天]、訪視3[第(42±2)天]，采集評價(jià)試驗(yàn)有效性的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。部分指標(biāo)因患者意愿而未完成檢測或記錄。主要觀測指標(biāo): ① 凝血指標(biāo)，包括D-D、FIB、APTT、TT; ② TF。次要觀測指標(biāo): ① 炎癥因子，包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α); ② 血小板聚集試驗(yàn)。

1.5 組織因子及炎癥因子檢測

采用ELISA法檢測血清中TF含量。選用人TF的ELISA試劑盒(貨號JM-03291H1), 采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測。方法為: ① 配制標(biāo)準(zhǔn)品; ② 在各孔中加入已稀釋的樣品; ③ 37 ℃反應(yīng)90 min; ④ 加入TF抗體工作液至酶標(biāo)板孔中, 37℃反應(yīng)60 min; ⑤ 洗滌后將ABC工作液依次加至酶標(biāo)板中，蓋上封板膜，37 ℃反應(yīng)30 min; ⑥ 洗滌后，加入TMB顯色液, 37℃避光反應(yīng)20 min后加入TMB終止液，酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度(OD)值。

采用CBA(Cytometric bead array)法檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量。選用試劑盒BDTMCytometric bead array(CBA)Human Inflammatory Cytokine Kit (貨號551811), 采用BD FACSCelestaTM流式細(xì)胞儀檢測。方法為: ① 制備標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品小球轉(zhuǎn)移到流式管中，稀釋液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，室溫下平衡15 min。② 混合細(xì)胞因子的捕獲微球，將IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α捕獲微球加入流式管中，充分渦旋混勻，室溫避光孵育30 min。③樣本檢測，混勻捕獲微球，加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本及PE檢測試劑。室溫避光孵育4 h, 洗滌，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件、ELISA處理軟件、Excel軟件分析結(jié)果。資料中符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)使用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)使用秩和檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)相關(guān)性采取雙變量相關(guān)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)選擇Pearson相關(guān)分析，不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)選擇Spearman相關(guān)分析。所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果均采取雙側(cè)檢驗(yàn),P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組患者凝血指標(biāo)比較

2組患者基線時(shí)D-D、FIB、APTT、TT差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 治療后，與對照組比較，試驗(yàn)組訪視3的D-D、FIB較低，TT延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 試驗(yàn)組訪視3的D-D較同組基線降低，對照組訪視2、訪視3的D-D較同組基線上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

自2008年，膠州市開展優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)示范區(qū)項(xiàng)目，進(jìn)行膠州市大白菜試驗(yàn)中心建設(shè)。膠州市聯(lián)合膠州大白菜協(xié)會，從育種、種子、收獲、包裝等環(huán)節(jié)對膠州大白菜進(jìn)行優(yōu)化。截止2010年底，有4家膠州大白菜種子開發(fā)企業(yè)注冊資金超過550萬元，有6家膠州大白菜加工企業(yè)其加工能力超過1200噸。

表1 2組不同時(shí)點(diǎn)凝血指標(biāo)比較

2.2 2組患者TF比較

2組基線時(shí)TF水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，試驗(yàn)組TF水平較對照組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 2組TF水平均較本組基線下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 2組TF表達(dá)比較

2.3 2組患者炎癥因子比較

2組基線時(shí)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 治療后，與對照組比較，試驗(yàn)組訪視3的IL-1β、TNF-α降低，其中2組訪視3的IL-1β差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組炎癥因子比較 pg/mL

2.4 2組患者血小板聚集試驗(yàn)對比

治療后，試驗(yàn)組訪視3的血小板聚集性低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 試驗(yàn)組訪視3的血小板聚集性較基線降低，對照組訪視3的血小板聚集性較基線上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 2組血小板聚集試驗(yàn)比較 %

2.5 凝血指標(biāo)與TF相關(guān)性分析

將2組基線的D-D、FIB與TF進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FIB與TF呈顯著正相關(guān)(r=0.447,P=0.001)。見表5。

表5 D-D、FIB與TF的相關(guān)性分析

2.6 試驗(yàn)組治療后FIB與TF水平變化的相關(guān)性分析

取試驗(yàn)組治療后FIB與TF水平的變化進(jìn)行相關(guān)性分析, FIB水平變化為(-0.20±0.77) mg/L(n=22), TF水平變化為(-39.46±39.85) ng/L(n=22), 結(jié)果顯示FIB與TF治療后的水平改變呈顯著正相關(guān)(r=0.433,P<0.05), 說明健脾化瘀方可能通過降低TF實(shí)現(xiàn)降低FIB的目的。

2.7 凝血指標(biāo)與炎癥因子的相關(guān)性分析

將2組基線的D-D、FIB與炎癥因子進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FIB與IL-1β呈顯著正相關(guān)(r=0.357,P=0.013), 見表6。

表6 D-D、FIB與IL-1β的相關(guān)性分析

2.8 試驗(yàn)組治療后FIB與IL-1β水平變化的相關(guān)性分析

取試驗(yàn)組治療后FIB與IL-1β指標(biāo)的變化進(jìn)行相關(guān)性分析, FIB水平變化為(-0.18±0.76) mg/L(n=13), IL-1β水平變化為(-9.45±20.91) ng/L(n=13), 結(jié)果顯示FIB與IL-1β治療后的水平改變呈正相關(guān)(r=0.555,P=0.049)。

2.9 安全性

試驗(yàn)組與對照組治療后白細(xì)胞減少(P=0.655)、血紅蛋白減少(P=0.250)、血小板減少(P=0.564)、轉(zhuǎn)氨酶比升高(P=0.927)、肌酐升高(P=0.333)、惡心嘔吐(P=0.686)、腹瀉(P=0.255)等不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7。

表7 2組治療后安全性指標(biāo)比較

3 討 論

目前國內(nèi)外腫瘤治療指南[17]均建議，對于不存在抗凝禁忌的腫瘤患者，應(yīng)預(yù)防性抗凝治療。然而，考慮到抗凝藥物的使用禁忌(如胃黏膜、胃瘤體的出血風(fēng)險(xiǎn)高，抗凝藥物與部分胃癌化療藥物同時(shí)使用存在禁忌)，預(yù)防性抗凝常難以有效實(shí)行，臨床多于血栓出現(xiàn)后才干預(yù)。研究[18]顯示中醫(yī)藥既可改善高凝狀態(tài)，又不易引發(fā)不良事件，并具備多靶點(diǎn)、可長期服用等優(yōu)勢。

健脾化瘀方為本院腫瘤科根據(jù)晚期胃癌患者脾胃氣虛為本、瘀毒互結(jié)為標(biāo)的病機(jī)特點(diǎn)所擬定的經(jīng)驗(yàn)方。前期研究[19-23]顯示，健脾化瘀方可改善患者的生活質(zhì)量，減輕化療的毒副反應(yīng)，抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)凋亡。現(xiàn)代藥理研究[24-25]證實(shí)，方中丹參、三七粉、三棱、莪術(shù)可通過抗血小板聚集、抑制血小板活化、干預(yù)凝血級聯(lián)反應(yīng)等途徑發(fā)揮抗血栓作用，黨參、黃芪、白術(shù)、茯苓、薏苡仁可通過抑制促血管生成因子的表達(dá)而下調(diào)IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β等炎癥因子分泌，抑制淋巴管和血管生成，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞炎性微環(huán)境[26-28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，健脾化瘀方可以降低試驗(yàn)組患者的D-D、FIB水平，延長TT時(shí)間，直接改善患者的血液高凝狀態(tài); 同時(shí)，還可降低TF水平，TF可激活凝血因子，啟動內(nèi)、外源性凝血酶聯(lián)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)[29-30], 是造成血液高凝狀態(tài)的重要因子。健脾化瘀方還可降低IL-1β、TNF-α的水平。IL-1β可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，介導(dǎo)單核細(xì)胞與血小板相互黏附，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附，促進(jìn)血栓形成，并可抑制蛋白C和組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)的分泌，抑制纖溶，促進(jìn)高凝[31-33]。TNF-α可通過激活單核細(xì)胞表達(dá)TF啟動凝血機(jī)制，活化血小板，抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)抗凝調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)凝血形成血栓[34]。

本研究對凝血指標(biāo)與TF、凝血指標(biāo)與炎癥因子進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，凝血指標(biāo)FIB與TF、IL-1β均呈顯著正相關(guān)，其水平的下降亦呈正相關(guān)。分析原因?yàn)? ① 健脾化瘀方具備改善血液高凝狀態(tài)和慢性炎癥的能力，可同時(shí)影響FIB、D-D、TT，降低炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)，證實(shí)本方具有綜合抗凝治療的潛力; ② 凝血指標(biāo)中的FIB水平與TF水平呈顯著正相關(guān)，經(jīng)健脾化瘀方治療后，F(xiàn)IB與TF水平下降亦呈正相關(guān)，提示TF所介導(dǎo)的促凝途徑可能造成FIB的增加，而致血液高凝，而健脾化瘀方可能通過降低TF的表達(dá)影響其所介導(dǎo)的促凝途徑; ③ 凝血指標(biāo)中的FIB水平與炎癥因子IL-1β水平呈正相關(guān)，提示血液高凝狀態(tài)與慢性炎癥存在相關(guān)性，治療后FIB與IL-1β水平的下降呈正相關(guān)，提示健脾化瘀方可能通過干預(yù)慢性炎癥因子IL-1β而改善血液高凝狀態(tài); ④ FIB與TF、IL-1β均具有相關(guān)性，是診斷胃癌血液高凝狀態(tài)和療效評價(jià)的重要指標(biāo)。