穿心蓮內(nèi)酯對(duì)糖尿病大鼠血糖及胰腺胰島素樣表皮生長(zhǎng)因子-1蛋白的影響

梁勇剛，石 靜，焦向英，王明亮，宋彬妤，王登妮

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島β細(xì)胞受損、胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足引起［1］。糖尿病時(shí)長(zhǎng)期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。因此，不斷提高對(duì)本病的早期診斷及進(jìn)一步開展糖尿病基礎(chǔ)和臨床研究，顯得極為重要。穿心蓮為常用中藥，具有清熱解毒、涼血消腫的功效。臨床上主要用于上呼吸道感染、急性菌痢、胃腸炎、感冒發(fā)熱、抗腫瘤及抗高血壓等方面的治療［2］，但對(duì)降血糖作用報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病大鼠模型，初步評(píng)價(jià)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)糖尿病大鼠血糖、胰腺胰島素樣表皮生長(zhǎng)因子（IGF-1）蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而為后續(xù)研究其可能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性大鼠60只，體重（200±50）g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥品與主要儀器 穿心蓮內(nèi)酯注射液（哈藥集團(tuán)三精藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130309）；鏈脲佐菌素（STZ）（Merck公司，批號(hào)582302）；三諾安穩(wěn)血糖儀和試紙條（長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司）；IGF-1兔抗大鼠多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz，批號(hào)SC689）；SV-002兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 建立糖尿病大鼠模型 將60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后禁食24 h斷尾采血測(cè)空腹血糖，隨機(jī)選10只作為正常對(duì)照組，正常對(duì)照組注射STZ的稀釋溶劑。其余50只大鼠注射1%STZ 50 mg／kg，7 d后禁食24 h測(cè)空腹血糖，血糖＞16.7 mmol／L者視為模型成立（每組至少10只）。

1.3.2 分組與用藥 選成模大鼠36只，隨機(jī)分為糖尿病模型對(duì)照組、穿心蓮內(nèi)酯低劑量組［100 mg／（kg·d）］、高劑量組［200 mg／（kg·d）］3組，每組12只。按照上述劑量分別給低、高劑量組注射穿心蓮注射液，正常對(duì)照組和糖尿病模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥2周后禁食24 h，斷尾取血測(cè)空腹血糖。

1.3.3 HE染色觀察大鼠胰腺形態(tài)變化 斷尾檢測(cè)各組大鼠空腹血糖后，常規(guī)麻醉大鼠，取出胰腺組織，用4%多聚甲醛固定24 h制成蠟塊切片，切片常規(guī)脫蠟，蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，鏡下觀察各組大鼠胰腺形態(tài)。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IGF-1蛋白表達(dá) 取大鼠胰腺石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水封閉，PBS洗滌，抗原修復(fù)、封閉后滴加一抗、二抗、DAB顯色，自來水中止，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，樹膠封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)大鼠血糖的影響 模型組與正常對(duì)照組比較，大鼠空腹血糖水平明顯升高（P＜0．05）；給藥2周后高、低劑量組與模型對(duì)照組比較，血糖明顯降低（P＜0．05），且量效關(guān)系明顯。詳見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯注射液對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖的影響±s）

表1 穿心蓮內(nèi)酯注射液對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖的影響±s）

組別 n 給藥前（mmol／L） 給藥后（mmol／L）正常對(duì)照組10 3.54±0.03 3.67±0.05模型對(duì)照組 12 3.68±0.06 25.67±3.551）低劑量組 12 4.06±0.05 14.56±2.341）2）高劑量組 12 3.98±0.08 8.37±1.561）2）與正常對(duì)照組比較，1）P＜0．05；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0．05

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)糖尿病大鼠胰腺形態(tài)的影響 正常對(duì)照組大鼠胰腺由胰腺小葉組成，胰腺小葉主要由腺泡構(gòu)成，腺泡內(nèi)分布大量大小不等的胰島。胰島細(xì)胞呈圓形或類圓形，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核居中，內(nèi)有大量分泌顆粒。模型對(duì)照組大鼠胰島明顯減少，胰島細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核體積增大，有的細(xì)胞核消失。與模型組比較，給藥后胰島明顯增多，細(xì)胞質(zhì)變得豐富，形態(tài)變得規(guī)則。

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)糖尿病大鼠胰腺IGF-1蛋白表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，IGF-1蛋白主要在正常胰島細(xì)胞胞漿表達(dá)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。正常對(duì)照組大鼠胰腺IGF-1蛋白高表達(dá)。與正常對(duì)照組相比較，模型對(duì)照組即糖尿病大鼠胰腺IGF-1蛋白表達(dá)降低。與模型對(duì)照組比較，用藥后高劑量組糖尿病大鼠胰腺IGF-1蛋白表達(dá)增加，其表達(dá)強(qiáng)度介于正常對(duì)照組和模型對(duì)照組之間。

3 討 論

胰島素樣生長(zhǎng)因子又稱為類胰島素生長(zhǎng)因子，是由70個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，在結(jié)構(gòu)上與胰島素有高度的同源性，除了介導(dǎo)生長(zhǎng)激素的作用外，對(duì)代謝有著類胰島素樣作用。IGF-1由肝、腎、胰、胸腺、睪丸等多種器官合成和分泌［3］。

研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可以改變糖代謝和脂代謝。糖尿病患者普遍存在IGF-1水平的降低［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，用穿心蓮內(nèi)酯注射液后，糖尿病大鼠血糖明顯下降。正常對(duì)照組大鼠胰腺組織均有IGF-1蛋白表達(dá)。糖尿病模型對(duì)照組大鼠胰腺IGF-1蛋白表達(dá)降低。穿心蓮內(nèi)酯注射液高劑量組大鼠胰腺IGF-1蛋白表達(dá)介于前二者之間。用藥后糖尿病大鼠血糖降低、胰腺IGF-1蛋白表達(dá)增加，表明穿心蓮內(nèi)酯注射液對(duì)糖尿病有一定治療作用。大鼠胰腺HE染色結(jié)果表明與模型組比較，給藥后胰島明顯增多，細(xì)胞質(zhì)變得豐富，形態(tài)變得規(guī)則。這一結(jié)果也證實(shí)了穿心蓮內(nèi)酯注射液對(duì)大鼠糖尿病有一定的治療作用。這些現(xiàn)象可能是由于長(zhǎng)期高血糖引起肝臟生長(zhǎng)激素抵抗，使生長(zhǎng)激素促進(jìn)IGF-1合成的作用喪失；高血糖及胰島素缺乏本身也可直接抑制IGF-1的合成［5］造成的。

［1］ 王璐璐，逢曙光，黃仙萍，等.辛伐他汀對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠血糖的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2013，34（4）：102-105.

［2］ 李榮，肖順漢.穿心蓮的藥理作用研究進(jìn)展［J］.四川生理科學(xué)雜志，2008，3（3）：131-133.

［3］ 羅曉敏，鄒海燕.IGF-1抑制妊娠合并糖尿病誘導(dǎo)的鼠胚胎細(xì)胞凋亡［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36（6）：121-126.

［4］ Han HJ，Park SH.Alteration of the gene and protein levels of insulin-like growth factors in streptozotocin-induced diabetic male rats［J］.J Vet Med Sci，2006，68（5）：413-419.

［5］ 劉波，林海，史紀(jì)文.細(xì)胞因子VEGF、IGF-1與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16（7）：89-94.