板藍根注射液的HPLC特征圖譜研究

王亞芳,段文龍,周艷飛*,李 浛,張連彥,鐘昆芮

（1.北京市獸藥監(jiān)察所，北京102629，2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

板藍根系十字花科植物菘藍（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，性寒、味苦，具有清熱解毒，涼血利咽的功效，為我國常用中藥材，其藥材和制劑質(zhì)量控制方法經(jīng)多年研究探索，正往多指標系統(tǒng)性質(zhì)量控制方向發(fā)展。近10年間，板藍根及其制劑指紋圖譜研究通過改變流動相系統(tǒng)、優(yōu)化梯度洗脫程序以獲得更多共有峰信息，并采用LC－ESI－MSn鑒定結(jié)構(gòu)和對照品指認的方法，確定共有峰中氨基酸類、核苷類、黃酮類、嘌呤和靛藍、靛玉紅等成分[1－4]。板藍根指紋圖譜研究為特征圖譜研究提供了有力支撐，形成了（R，S）－告依春為參照峰，特征峰為尿苷、腺苷的板藍根特征圖譜以及表告依春為參照峰，特征峰為尿苷、鳥苷、腺苷的板藍根特征圖譜等。特征圖譜色譜條件進一步簡化流動相為甲醇－磷酸溶液系統(tǒng)[5－6]。板藍根注射液是一種常見獸藥品種，在治療家禽流感、仔豬黃痢方面具有良好的治療效果，獸醫(yī)臨床應(yīng)用范圍嘗試逐漸拓寬，如治療畜禽敗血霉形體感染、水貂阿留申病等[7－9]，目前收錄于《獸藥質(zhì)量標準》2017年版中。在現(xiàn)行的質(zhì)量標準中只包括對其中的精氨酸、亮氨酸、L－脯氨酸進行薄層鑒別和對（R，S）－告依春組分進行含量測定[10]。為了從整體上控制板藍根注射液的質(zhì)量，同時進一步控制原料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，本實驗采用高效液相色譜法，綜合現(xiàn)有板藍根及其制劑特征圖譜標定的特征峰，參考現(xiàn)行的質(zhì)量標準[10]板藍根注射液（R，S）－告依春含量測定法使用甲醇－水系統(tǒng)，建立了板藍根注射液的HPLC特征圖譜分析方法，為進一步全面控制板藍根注射液的質(zhì)量提供了技術(shù)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測器（美國沃特世公司）；METTLER XS205型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；DTL 500型超聲波清洗機（北京德泰隆科技發(fā)展有限責任公司）；Milli－Q 型超純水儀（Advantage A10）。

1.2 材料 甲醇為色譜純；水為超純水；（R，S）－告依春對照品（批號 111753－201706，含量100.0%，中國食品藥品檢定研究院）；尿苷對照品（批號111887－201803，含量99.5%，中國食品藥品檢定研究院）；鳥苷對照品（批號 111977－201501，含量93.6%，中國食品藥品檢定研究院）；腺苷鳥苷對照品（批號 111879－201703，含量99.7%，中國食品藥品檢定研究院）；板藍根注射液樣品14批，來源見表1。

表1 板藍根注射液樣品信息Tab 1 Banlangen injection sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Waters Atlantis T3（5μm，4.6×250 mm）色譜柱，以甲醇為流動相A，以水為流動相B，按表2中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速為0.8 mL/min；柱溫30℃；檢測波長為250 nm；進樣體積10μL。

表2 板藍根注射液特征圖譜梯度洗脫條件Tab 2 Gradient elution conditions of Banlangen injection characteristic spectrum

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取 （R，S）－告依春對照品、尿苷對照品、鳥苷對照品和腺苷對照品各5 mg，置同一100 mL量瓶中，加5%甲醇適量，超聲溶解后并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL，置5 mL量瓶中，用5%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品混標溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取板藍根注射液樣品，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 檢測波長的選擇 以PDA檢測器進行全波長掃描，比較板藍根注射液樣品在200～400 nm的吸收譜圖，發(fā)現(xiàn)板藍根注射液在250 nm波長處得到的色譜峰響應(yīng)值較理想，且各峰分離良好。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取同一份樣品，連續(xù)進樣6次，按上述色譜條件測定，各色譜峰相對保留時間的RSD＜0.2%，各色譜峰峰面積的RSD＜2%，結(jié)果表明儀器系統(tǒng)精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品，按上述色譜條件測定，分別在 0、2、4、8、16、24、30 h 檢測，各色譜峰相對保留時間的RSD＜0.5%，結(jié)果表明板藍根注射液樣品穩(wěn)定。

2.6 板藍根注射液特征圖譜的建立及相似度評價

2.6.1 特征圖譜的建立 在上述色譜條件下，測定混合對照品溶液及板藍根注射液樣品，將色譜圖的數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以S2樣品色譜圖為參照圖譜，采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法進行多點校正，時間窗寬度0.1 s，進行自動匹配，建立共有模式，共建立9個共有峰，得到典型色譜圖見圖1，不同批次樣品疊加圖見圖2，板藍根注射液樣品部分放大圖見圖3。

2.6.2 共有峰的確認 將9個共有峰與對照品色譜圖比對，確認其中的3號峰為尿苷，7號峰為鳥苷，8號峰為（R，S）－告依春，9號峰為腺苷，由于（R，S）－告依春是板藍根藥材中的質(zhì)控指標組分，并且在注射液中的含量相對較高，因此，設(shè)定為參考峰，標記為峰S。計算各特征峰與S峰的相對保留時間，結(jié)果表明各特征峰的相對保留時間RSD＜1.8%，具有較好的重現(xiàn)性。按照技術(shù)要求，初步得到板藍根注射液的特征圖譜的技術(shù)參數(shù)（表3）。

圖1 板藍根注射液樣品和對照品的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of samples and reference materials of Banlangen injection

表3 板藍根注射液HPLC特征圖譜中特征峰保留時間Tab 3 Characteristic peak retention time in HPLC characteristic spectrum of Banlangen injection

2.6.3 相似度評價結(jié)果 將14批板藍根注射液樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，得出相似度評價結(jié)果表（表4）。

圖2 板藍根注射液樣品不同批次疊加圖譜Fig 2 Overlay spectrum of different batches of Banlangen injection samples

圖3 板藍根注射液樣品部分放大圖Fig 3 Partial enlargement of Banlangen injection sample

表4 樣品特征圖譜與對照圖譜的相似度評價結(jié)果Tab 4 Similarity evaluation results of sample characteristic spectrum and reference characteristic spectrum

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜柱的選擇 本文共測試4支色譜柱，另外3支分別是Agilent HC－C18（2）、Agilent Eclipse XDB －C18、Waters SunFireTMC18，雖然都能較好的分離板藍根注射液中的組分，但是相對保留時間差異較大，RSD約為8%。因此，本實驗需要固定色譜柱型號，使用Atlantis T3柱來檢測特征圖譜，9個共有組分峰的相對保留時間RSD均小于5%，滿足實驗要求。

3.2 檢測波長的選擇 本文采用PDA檢測器，由各組分的光譜圖可以得出最大吸收波長:若檢測波長為260 nm（尿苷和腺苷最大吸收波長）時，告依春響應(yīng)值最低，由于告依春是主要成分，在色譜圖中峰高較小，若含量低時可能檢不出；若檢測波長為240 nm（告依春最大吸收波長）和245 nm（常用波長）時，腺苷組分響應(yīng)值最低，若含量低時可能檢不出；比較檢測波長250、252、254 nm時，3種核苷類組分響應(yīng)值相似，告依春組分是在250 nm響應(yīng)最大，因此，最終選用250 nm作為檢測波長。

3.3 不同生產(chǎn)企業(yè)、不同產(chǎn)地藥材的差異 樣品S1～S10來自不同生產(chǎn)企業(yè)，板藍根藥材也來自不同產(chǎn)地，藥材品質(zhì)也存在不同。相似度評價結(jié)果表明14批樣品中只有8批其相似度均在0.90以上，說明不同來源的樣品間相似度有差異，但是并不影響特征峰的判斷。

本文所建立特征圖譜與現(xiàn)行標準[10]板藍根注射液（R，S）－告依春高效液相色譜法含量測定方法相比，梯度洗脫條件不同、檢測波長更優(yōu)化。本方法在盡可能獲得更多共有峰的同時可使包括（R，S）－告依春在內(nèi)的所有特征峰出峰時間適宜、分離度良好、峰形更佳。板藍根注射液特征圖譜未見報道，本方法與已報道的板藍根藥材或其制劑特征圖譜相比，特征峰選擇更接近現(xiàn)行標準質(zhì)量控制指標成分，流動相系統(tǒng)由甲醇－磷酸溶液系統(tǒng)簡化為甲醇－水系統(tǒng)，與同流動相系統(tǒng)指紋圖譜比較標定了更多特征峰、特征峰分離度更好。

迄今為止，尚無公認能反映板藍根內(nèi)在質(zhì)量的指標成分用于控制其藥材及制劑的質(zhì)量，現(xiàn)行的標準[10－11]主要在高效液相色譜法測定（R，S）－告依春的含量、薄層色譜法鑒別氨基酸類成分等方面對板藍根注射液進行質(zhì)量控制。本實驗采用HPLCPDA法，建立板藍根注射液HPLC特征圖譜，靈敏度更高，準確性更好。板藍根注射液特征圖譜中9個特征峰包括（R，S）－告依春、核苷類成分和另外5個特征性成分，能更好、更全面地表達中藥復(fù)雜體系，有效評價板藍根注射液內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性。該方法簡便靈敏，重復(fù)性好，進一步優(yōu)化洗脫條件能提升分離效果，獲得更多成分信息，可作為板藍根注射液有效的鑒別和質(zhì)量評價方法，是現(xiàn)行標準的有益補充，為中獸藥標準化提供參考。