量子點標記技術(shù)在食源性病原體檢測中的研究進展

金瑩 房保海 姜英輝等

摘要近年來，量子點標記技術(shù)得到較快發(fā)展，以其為基礎(chǔ)開發(fā)的檢測技術(shù)在食品安全檢測方面已有廣泛應(yīng)用。為了解量子點標記技術(shù)在食源性病原體檢測中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀，為量子點標記技術(shù)在食品安全檢測中進一步深入推廣，簡要綜述了量子點的生物相容性及其在食源性病原體檢測方面的研究進展和應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞量子點標記；食源性病原體；檢測

中圖分類號R184.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00245-03

基金項目國家質(zhì)檢總局項目“基于量子點標記技術(shù)的食源性致病菌快速檢測技術(shù)研究”（2011IK221）。

作者簡介金瑩（1981- ），女，山東沂水人，農(nóng)藝師，博士，從事食品安全研究，Email：jiny81@163.com。*通訊作者，博士，從事食品安全與檢測研究。

收稿日期20131210量子點（QDs）又稱為半導(dǎo)體納米微晶粒，是一種由Ⅱ～Ⅵ 族元素（如 CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或III～V族元素（如InP、InAs等）組成，直徑在1～100 nm的納米顆粒，目前研究較多的主要是 CdX（X = S、Se、Te）[1-2]。量子點材料早期多應(yīng)用于物理、電子和材料工程領(lǐng)域，1998年美國加州伯克利大學(xué)的Alivisatos 小組和印地安納大學(xué)Nie小組幾乎同時提出熒光量子點可應(yīng)用于生物標記這一觀點，開創(chuàng)了熒光量子點在生物技術(shù)中研究應(yīng)用的先河。隨后，量子點技術(shù)在生命科學(xué)、分析科學(xué)、材料科學(xué)、免疫醫(yī)學(xué)、檢驗檢疫科學(xué)等傳統(tǒng)及新興的領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用。

食源性致病菌引起的食源性疾病是引起食品安全的最大隱患之一，越來越受到各國的重視，而目前已報道的食源性致病菌檢測方法都各有其缺陷，為了適應(yīng)檢測需要，不斷研究發(fā)展靈敏度更高、普遍適用性更好、更為快速簡便的新型檢測方法就顯得非常有意義。筆者重點綜述了量子點的特性及其在食源性病原體檢測中的研究進展，并對其在今后食品安全檢測方面的發(fā)展前景予以展望。

1量子點的生物相容性

生物相容性是指材料與生物體之間相互作用后產(chǎn)生的各種生物、物理、化學(xué)等反應(yīng)。即是指材料植入人體后與人體相容程度，是否會對人體組織造成毒害作用。這一概念可以從以下3個方面來解釋[3]：一是該材料不僅是簡單地存在于生物體內(nèi)，而必須扮演某一角色；二是該材料對生物體給予的某些反應(yīng)應(yīng)該產(chǎn)生回應(yīng)；三是該材料必須具有普遍適用性。生物相容性包括兩大原則[4]：一是生物安全性原則，即生物材料對人體無破壞性；二是生物功能性原則（或稱為機體功能的促進作用），指材料在特殊的環(huán)境中能夠激發(fā)生物體恰當應(yīng)答的能力。

1.1量子點的細胞毒性量子點種類繁多，組成成分不同，因此每種量子點的毒性也不同。目前主要從量子點的暴露途徑（職業(yè)暴露或自主暴露等）、暴露濃度、量子點的種類、表面修飾試劑的類型和環(huán)境因素等方面來研究量子點的毒性[5]。

Derfus等以裸露的CdS量子點和表面帶有修飾試劑（巰基乙酸和半胱胺酸）的CdS量子點對人胚肝細胞進行標記[6]。試驗結(jié)果表明，裸露的CdS量子點在人胚肝細胞中Cd2+的釋放率遠高于表面帶有修飾試劑的CdS量子點的釋放率，約為15%～25%，從而對生物體產(chǎn)生毒害作用。其原因可能是Cd2+在細胞外抑制細胞的增殖存活能力，或者是細胞通過吞食作用使量子點進入細胞內(nèi)，此時Cd2+與細胞直接接觸，從而對細胞產(chǎn)生損害作用。

Lovric等研究了CdTe量子點的粒徑和濃度對PCl2和Ng細胞的影響[7]。結(jié)果表明，量子點的大小決定了其在細胞中的分布。細胞質(zhì)中以大粒徑的CdTe量子點為主，而細胞核中以小粒徑的CdTe量子點為主；當不同粒徑的量子點在相同濃度下，小粒徑和大粒徑的量子點對細胞代謝活性的抑制率分別為（46.8±2.3）%和（68.8±1.4）%，表明小粒徑量子點的毒性較大。另外，量子點所帶電荷不同，對細胞的破壞程度也不相同。

su等比較了K562細胞在CdTe、CdTe@CdS、CdTe@CdS@ZnS 3種水溶性量子點存在下的細胞毒性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，由于量子點中Cd2+的釋放致使CdTe和CdTe@CdS對細胞的毒性較大；而高濃度CdTe@CdS@ZnS量子點長時間與細胞作用，對細胞的毒性小于前2種量子點，這可能是由于最外層ZnS的存在阻礙了Cd2+的釋放。這進一步說明了量子點的結(jié)構(gòu)不同，對細胞的毒害作用也不同。

1.2量子點的氧化及降解Derfus等考察了MAATOPOcapped CdSe QDs 對鼠肝細胞的影響[6]。量子點表面的修飾試劑由于光解和氧化作用而發(fā)生降解，從而使鼠肝細胞死亡。肝細胞毒性與量子點周圍的環(huán)境和濃度有關(guān)，先將MAATOPOcapped CdSe QDs 暴露在空氣或紫外燈下，然后讓其與鼠肝細胞相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞活性顯著降低。這可能是由于在氧化和光解條件下引起了MAATOPOcapped CdSe QDs 的分解，使游離Cd2+濃度增加而引起的。

Chen等將二氧化硅包覆的CdSe@ZnS量子點與肽偶聯(lián)用來研究活體細胞成像[9]。當量子點與細胞的量為比為100∶1006、10∶106 和1∶106時，研究發(fā)現(xiàn)該量子點對Hela細胞的存活影響較小。這表明硅殼可以有效地阻止Cd、Se、Zn和S 與細胞核中的蛋白質(zhì)和DNA之間發(fā)生相互作用。

1.3量子點修飾試劑對細胞毒性的影響Hoshino等通過MTT 試驗發(fā)現(xiàn)，在WTKI細胞內(nèi)以巰基十一酸（MUA）、L半胱氨酸（LCys）和硫代甘油（MPP）修飾的CdSe@ZnS量子點，由于表面修飾試劑的氧化或在體內(nèi)酸性條件下脫落而釋放到細胞質(zhì)中，進一步對細胞產(chǎn)生毒害作用[10]。將WTKI細胞與MUA capped CdSe @ZnS QDs或LCyscapped CdSe @ZnS QDs 或MPPcapped CdSe @ZnS QDs培養(yǎng)12 h，量子點劑量大于100 μg/ml時，MUA capped CdSe @ZnS QDs和LCyscapped CdSe @ZnS QDs 均會表現(xiàn)出嚴重的細胞毒性，而MPPcapped CdSe @ZnS QDs 的毒性幾乎可以忽略。而DNA與量子點（>50 μg/ml）培養(yǎng)2 h便可觀察到DNA的損傷。

2量子點標記技術(shù)在食源性病原體檢測中的研究成果

2.1量子點標記技術(shù)在細菌污染檢測中的研究應(yīng)用量子點標記技術(shù)既可準確檢測出食品中致病微生物種類，也可進行定量分析，從而大幅提高食品安全性。

繆婷婷等于2010年將納米探針技術(shù)與熒光分析方法結(jié)合應(yīng)用于DNA雜交分析，以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌特定序列DNA為模式分析物，建立了超微量新型分析方法體系[11]。同時將其作為發(fā)光成像標記物，對小鼠不同生理狀態(tài)下的巨噬細胞成像進行了觀察分析，進一步拓寬了量子點的應(yīng)用。在試驗最佳條件下，沙門氏菌目標DNA檢出限為20 fmol/L，李斯特菌目標DNA檢出限為25 fmol/L，金黃色葡萄球菌目標DNA檢出限為22 fmol/L。

Tully等利用量子點標記抗體，通過熒光免疫法測定單增李斯特菌表面結(jié)合蛋白來檢測單增李斯特菌[12]。Hahn等利用親合素標記CdSe/ZnS核殼型量子點檢測大腸桿菌O157∶H7，檢測限可達2.08×107 CFU/ml[13]。

鄒明強等結(jié)合免疫技術(shù)和量子點磁性分離技術(shù)，采用便攜式光譜儀定量測定大腸桿菌O157：H7，檢出限比普通異硫氰酸熒光素（FITC）標記低100倍，分析在2 h內(nèi)完成[14]。

Wang等利用免疫磁性分離技術(shù)檢測培養(yǎng)液中單增李斯特菌，首先偶聯(lián)鏈霉親和素的磁性納米珠與含單增李斯特菌的培養(yǎng)液混合，磁性分離后與偶聯(lián)量子點混合，通過測定磁性納米珠-單增李斯特菌-量子點結(jié)合物的熒光強度來檢測培養(yǎng)液中單增李斯特菌，檢測線性范圍100～107 CFU/ml，檢測限低達2～3 CFU/ml，檢測時間為1.5 h[15]。

此外，利用不同顏色熒光量子點標記不同致病微生物抗體，可同步檢測食品中多種致病微生物。Xue等利用水溶性量子點標記大腸桿菌E.coli和金黃色葡萄球菌S.aureus，檢測范圍為102～107 CFU/ml，檢測時間為1～2 h[16]。Yang等利用525、705 nm量子點分別標記大腸桿菌E.coli O157∶H7和傷寒沙門氏菌S.Dphimurium抗體，偶聯(lián)抗體的免疫磁珠預(yù)處理分離后，免疫磁珠-細菌混合物與量子點結(jié)合能特異性識別相應(yīng)的致病微生物，檢測限為1×104 CFU/ml，檢測在2 h內(nèi)完成[17]。

2.2量子點標記技術(shù)在生物毒素污染檢測中的研究生物毒素又稱天然毒素，是指生物來源并不可自復(fù)制的有毒化學(xué)物質(zhì)，包括動物、植物、微生物產(chǎn)生的對其他生物物種有毒害作用的各種化學(xué)物質(zhì)。生物毒素除對人類的直接中毒危害外，還可以造成農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)的損失和環(huán)境危害，因此，檢測食品中生物毒素是極其重要的。

Goldman等將重組蛋白結(jié)合于CdSe/ZnS核殼型量子點上，再與抗體相連，可用于熒光檢測葡萄球菌腸毒素B，檢測限為10 ng/ml[18]。Goldman等用不同粒徑CdSe/ZnS量子點分別標記抗蓖麻毒素、霍亂毒素、志賀菌毒素l和葡萄球菌腸毒素B的抗體，可在同一塊微孔板上實現(xiàn)4種毒素的同時監(jiān)測，可獲得樣品中病毒的種類及含量[19]。楊淑平等分別采用巰基乙酸和谷胱甘肽作穩(wěn)定劑，水相合成CdTe量子點，再包覆CdS制備核殼型CdTe/CdS量子點[20]。以EDC/NHS作交聯(lián)劑將CdTe/CdS量子點標記到嘔吐毒素抗體上，然后用牛血清蛋白封閉抗體。研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽穩(wěn)定劑優(yōu)于巰基乙酸。與CdTe量子點相比，谷胱甘肽修飾的CdTe/CdS量子點其熒光的強度和穩(wěn)定性分別提高6倍和2倍以上。谷胱甘肽碳鏈較長，減少了量子點對抗體尤其是活性位點處的空間構(gòu)型影響，大大提高抗體的穩(wěn)定性。監(jiān)測不同儲藏時間（4 ℃）的CdTe/CdS量子點-抗體偶聯(lián)復(fù)合物與嘔吐毒素免疫反應(yīng)前后熒光強度變化值，結(jié)果顯示，抗體至少可以穩(wěn)定7 d?；诠入赘孰姆€(wěn)定的高性能CdTe/CdS量子點，建立一種新的嘔吐毒素熒光免疫檢測方法。嘔吐毒素濃度在0～0.9 ng/ml相對熒光強度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 2，檢出限是0.038 ng/ml。方法的靈敏度高于文獻報道的其他方法，如GCECD、HPLC和HPLCMS，已成功應(yīng)用于小麥面粉樣品中痕量嘔吐毒素的測定。

周曉燕等將谷胱甘肽作穩(wěn)定劑水相合成CdTe/CdS核殼型量子點，以EDC/NHS為活化劑對黃曲霉毒素B1（AFB1）抗體進行量子點標記，然后用牛血清蛋白封閉抗體[21]。通過對量子點和標記抗體性能的研究發(fā)現(xiàn)，CdTe/CdS核殼型量子點熒光的強度和穩(wěn)定性較裸殼的CdTe量子點分別提高了4倍和2倍以上。由于谷胱甘肽碳鏈較長，量子點對抗體尤其是活性位點處的空間構(gòu)型影響減少，從而改善了量子點標記抗體的穩(wěn)定性和活性，CdTe/CdS標記的AFB1抗體與AFB1免疫前后熒光強度變化顯示抗體至少可以穩(wěn)定6 d?；诠入赘孰姆€(wěn)定的高性能CdTe/CdS量子點，建立了一種熒光免疫檢測黃曲霉毒素B1的新方法。AFB1濃度在0.68～40 pmol/L，熒光強度與濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.991 4，檢出限為0.3 pmol/L。方法已成功應(yīng)用于米醋樣品中痕量黃曲霉毒素B1的測定。

孟元華等建立了一種基于CdSe/CdS量子點（QDs）標記技術(shù)測定微囊藻毒素LR（MCLR）的方法[22]。MCLR抗體經(jīng)1乙基3（3二甲基胺基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）活化，與經(jīng)巰基乙酸修飾的CdSe/CdS量子點進行共價連接，獲得的QDs生物共軛體在待測物MCLR的作用下發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，熒光猝滅程度與MCLR的濃度呈線性關(guān)系。該方法操作簡單、檢測速度快、檢出限低達6.9×10-11mol/L。

2.3量子點標記技術(shù)在其他微生物污染檢測中的研究孔瀟藝等在2011年以量子點為探針建立簡便快速的病原微生物檢測方法，采用配體交換法將具有微生物特異性的糖鏈，偶聯(lián)到CdSeS/ZnS量子點表面，制備2種糖量子點復(fù)合材料（甘露糖-量子點和半乳糖-量子點）。通過對它們的結(jié)構(gòu)、物性和光譜學(xué)特性進行表征[23]，結(jié)果顯示，2種糖量子點均具有良好的水溶性、熒光發(fā)射和紫外-可見光吸收性能。進一步以這2種糖量子點為探針與凝集素共孵育后，溶液顏色和熒光發(fā)射光譜的變化表明，甘露糖-量子點對刀豆蛋白具有特異性，最低可檢測濃度為95 nmol/L；而半乳糖-量子點對蓖麻毒素具有特異性，最低可檢測濃度為3 nmol/L。該研究為進一步建立病原微生物的檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

3前景展望

社會的進步和人們生活水平的提高對食品安全檢測技術(shù)提出了更高的要求，而傳統(tǒng)的檢測方法在一定的程度上已經(jīng)不能夠滿足現(xiàn)有的檢測要求。近年來，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展和量子點標記技術(shù)的日臻完善，量子點在食品安全檢測領(lǐng)域的應(yīng)用顯示了巨大的學(xué)術(shù)價值和良好的商業(yè)前景。在這樣的前提下，先進的納米技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法的結(jié)合，產(chǎn)生了許多具有檢測時間短、檢測靈敏度高的檢測方法，在很大程度上改變了食品安全檢測領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀。這些方法在檢測靈敏度、檢測時間、檢測樣品量等方面都能夠很好地滿足目前嚴峻的食品安全檢測形勢，可以相信，當前先進量子點標記技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測方法進一步結(jié)合，將研究出更多新型簡便可行的檢測方法，為食品安全檢測與監(jiān)控的進一步發(fā)展提供強有力的技術(shù)支持，從而充分保障人民群眾日常生活中的食品安全。

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