辣椒花器官發(fā)育PAP3基因和PDS基因VIGS載體的構(gòu)建及鑒定

馬寧 劉辰 王茹芳 沈火林

摘 要： 以辣椒恢復系121C為材料，采用RT-PCR技術(shù)從121C花藥中克隆得到控制花器官發(fā)育B類基因PAP3的部分序列，片段長379 bp，陽性對照八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoene desaturae，PDS），片段長323 bp，然后通過酶切分別連接pTRV2質(zhì)粒，獲得重組載體pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS。利用PCR進行初步鑒定后進行序列測定。結(jié)果表明，辣椒PAP3基因和PDS基因已插入到pTRV2載體上，VIGS載體構(gòu)建成功。該研究為下一步分析基因沉默和辣椒花器官的發(fā)育提供了試驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 辣椒； PAP3； 病毒誘導基因沉默； 花器官發(fā)育

Construction and Identification of Flowering-related PAP3 Gene and

PDS Gene VIGA Vector in Pepper

MA Ning， LIU Chen， WANG Ru-fang， SHEN Huo-lin

（Department of Vegetable Science， College of Agronomy and Biotechnology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract： In order to study the efficiency of gene-silencing in pepper floral organ development，part of the sequence fragment，length 379 bp，and positive control eight hydrogen lycopene dehydrogenase gene（phytoene desaturae，PDS）fragment，length 323 bp，were obtained from the anther of pepper restore line 121C as materials via semi-quantitative RT-PCR. Connecting two genes individually to the pTRV2 plasmid，vector pTRV2-pPAP3 and pTRV2-PDS were restructured. After the preliminary identification with the help of PCR，the full construct was sequenced for confirmation. The result showed that PDS and PAP3 genes were inserted into the pTRV2 carrier. This study provided the test materials for further analysis in gene-silencing of pepper floral organ development and created a new approach for pepper male sterility breeding.

Key words： Capsicum annuum L.； PAP3； VIGS； Floral organ development

病毒誘導的基因沉默（VIGS）為我們提供了一種快速的沉默目的基因的方法，已被越來越多的用于快速鑒定植物中各種基因的功能。目前該技術(shù)在茄科作物上的應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)流程也相對較為成熟。這種方法是從研究病毒和寄主或轉(zhuǎn)基因之間的相互作用發(fā)展而來[1-2]。目前開發(fā)的病毒載體主要是RNA病毒，如煙草花葉病毒（TMV），煙草脆裂病毒（TRV），馬鈴薯X病毒（PVX），大麥條紋花葉病毒（BMSV），衛(wèi)星煙草花葉病毒（STMV）等。DNA病毒也有研究報道，主要是番茄金黃花葉病毒（TGMV）和甘藍卷葉病毒（CaLCuV）[3-4]。煙草脆裂病毒（TRV）是現(xiàn)在使用較多的病毒載體，因為該病毒在寄主上侵染后對寄主的影響較溫和，而且其寄主范圍較廣 [5-6]。目前研究表明，一些基因已經(jīng)成功在辣椒中通過VIGS技術(shù)被沉默[7]。

PDS 是類胡蘿卜素合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，如成功將該基因沉默，植株將會表現(xiàn)光漂白癥狀，最早用來作為指示標記研究 TMV 在煙草上的基因沉默效應(yīng)。類胡蘿卜素在植物中具有光保護作用，當包含 PDS 基因片段的重組 TMV 病毒侵染植物后，PDS 的 mRNA 表達受到抑制，侵染發(fā)病的煙草葉片會變成白色。 PDS基因沉默后的植株表型變異易于辨別，因此，該基因是評價 VIGS 體系是否有效的參照基因。

PAP3基因均屬于 MADS-box基因家族中控制花器官發(fā)育的B類基因，參與花瓣和雄蕊的形成。經(jīng)研究表明B 類基因喪失功能的突變體中，萼片代替第 2 輪花瓣，第 3輪雄蕊轉(zhuǎn)變?yōu)樾钠8-9]。本研究分別構(gòu)建了PAP3基因和PDS 基因的VIGS載體，并對載體進行鑒定證明其可靠性，將兩載體侵染辣椒恢復系植株121C，為下一步分析基因沉默后的辣椒花器官的發(fā)育提供試驗材料，以便進一步探討PAP3基因?qū)苯坊ㄆ鞴侔l(fā)育和雄性不育之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料種植

以辣椒細胞質(zhì)雄性不育恢復系121C為試驗材料（本實驗室育種材料）。2011年春季在中國農(nóng)業(yè)大學上莊實驗站大棚內(nèi)常規(guī)種植。在開花期，取121C花瓣已開始變白的花蕾，剝?nèi)』ㄋ幜⒓从靡旱鋬霾⒃?70 ℃ 保存?zhèn)溆?，用于基因片段克隆?/p>

1.2 總RNA的提取

總 RNA 的提取依照 SV Total RNA Isolation System kit（美國 Promega 公司）操作說明書進行?；蛉L克隆采用 RACE 技術(shù)，按照 Smart Race cDNA Amplification Kit（美國 Clontech 公司）試劑盒說明書進行。

1.3 載體構(gòu)建及鑒定

用于建立病毒誘導的基因沉默 （VIGS） 體系的TRV？載體pTRV1和pTRV2由清華大學劉玉樂教授惠贈。PDS基因VIGS 載體的引物序列為：PDS- F 5‘-GCTTATCTTTGGAGCTCGAGG-3； PDS- R 5‘- CGGGATCCCGCCACCTAGAACATC -3；PAP3基因是本實驗室前期研究中通過辣椒不育系和恢復系的差減cDNA文庫中獲得的辣椒恢復基因誘導的PAP3基因片段。通過RACE技術(shù)獲得全長，全長克隆到 PMD18？T 載 體中。用于構(gòu)建PAP3基因 VIGS 載體的引物序列分別為：PAP3-F 5‘- GGAATTCCGCAGGAAGGAGACTACAACT-3； PAP3-R 5‘- CGGGATCCCGAAACATTAAAAGATA-3。PCR 擴增總體系為20 μL，稀釋 10 倍的 cDNA 1.0 μL，引物濃度為 10 μmol·L-1各 0.6 μL，2 uTaq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.8 μL。PCR 的擴增條件為：94 ℃/3 min；94 ℃/30 s，54 ℃/30 s，72 ℃/45 s，25 cycles；72 ℃/5 min，最后 4 ℃ 保存。PCR 產(chǎn)物用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。 擴增得到 的 PCR 產(chǎn)物用 DNA 快速回收純化試劑盒純化（Takara，日本），PDS基因和PAP3基因均采用限制性內(nèi)切酶 EcoRI和BamHI雙酶切，連接到同樣用EcoRI和BamHI雙酶切的pTRV2載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)中，菌液 PCR 篩選陽性克隆并測序驗證，獲得序列正確的載體質(zhì)粒即為重組載體pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒PDS基因和PAP3基因片段克隆及序列分析

根據(jù)GeneBank發(fā)表的辣椒PDS基因序列（GenBank：x68058），選取PDS基因中部（54～434 bp）序列，以辣椒花藥總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄出的cDNA，通過PCR擴增到目的基因片段長度為323 bp。與預(yù)期一致，通過連接載體，雙酶切、測序，最終測序結(jié)果與發(fā)表的基因序列一致，可以用于構(gòu)建病毒載體（圖1）。

圖1 PDS目的基因片段的擴增

通過對PAP3序列進行分析選用EcoRI和BamHI這兩種內(nèi)切酶進行酶切位點的連接，連接好酶切位點引物擴增PAP3基因的編碼區(qū)。以辣椒花藥總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄出的cDNA，通過PCR擴增到目的基因片段PAP3的非編碼區(qū)為379 bp，包含兩個酶切位點對擴增結(jié)果進行電泳（圖2）及測序分析，得到的PAP3基因片段大小與預(yù)期的相同，結(jié)合序列分析結(jié)果，確定擴增得到了目的基因的片段。

2.2 pTRV2重組載體構(gòu)建及鑒定

因為農(nóng)桿菌中質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低，所以將PCR擴增的PDS基因和PAP3基因片段轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，當構(gòu)建TRV病毒載體時，對其進行質(zhì)粒提取。對pTRV2和從大腸桿菌中所提取的目的基因的質(zhì)粒同時進行雙酶切，再用T4 DNA連接酶進行連接。將連接好的重組載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌的感受態(tài)細胞，通過涂布含有50 μg·mL-1 Kan和25 μg·L-1 Rif的固體YEB培養(yǎng)基進行陽性菌斑的篩選，得到含有重組載體的菌斑，重組的載體結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 目的基因重組病毒載體的結(jié)構(gòu)

利用材料里提兩對鑒定引物對病毒載體重組病毒載體pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS進行擴增，另外對載體pTRV1利用引物pTRV1-F 5‘- TTACAGGTTATTTGGGCTAG -3； pTRV1-R 5‘- CCGGGTTCAATTCCTTATC-3進行擴增。擴增結(jié)果如圖4所示。擴增片段的大小與預(yù)期相同。提取電泳檢測結(jié)果為陽性重組病毒載體的農(nóng)桿菌的質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與發(fā)表的基因序列一致，可以用于侵染辣椒植株。

圖4 目的基因病毒載體片段擴增電泳圖

M，100 bp DNA Marker；泳道1～3分別為pTRV1、pTRV2-PDS和pTRV2-pPAP3載體檢測結(jié)果。

3 討 論

細胞質(zhì)雄性不育在植物界中普遍存在，在蔬菜作物的雜種優(yōu)勢利用及品種改良等方面具有重要的經(jīng)濟價值和社會效益，同時在辣椒中，CMS也是研究花粉發(fā)育過程及其機理、細胞質(zhì)遺傳、細胞核遺傳中應(yīng)用較多的材料，通過對恢復相關(guān)基因的研究也可以成為揭示雄性不育分子機理的突破點，為雄性不育系、雄性不育恢復系的獲得提供新的思路和途徑，也為其他園藝作物的研究提供了借鑒[10-11]。辣椒為兩性花，但雄蕊的不正常發(fā)育，會產(chǎn)生不正常的花藥或者花粉，以致發(fā)生雄性不育。PAP3基因是從實驗室已經(jīng)構(gòu)建得到的辣椒育性恢復基因誘導表達的cNDA文庫中篩選獲得的[12]，并以獲得基因全長（文章正在投稿），在所有的被子植物中，無論是分化成明顯的花萼和花瓣，還是沒有明顯花萼和花瓣之分的花被中，都檢測到AP3類基因的表達。說明在所有的被子植物中，AP3類基因都參與到花瓣狀器官的發(fā)育過程中。在以擬南芥、金魚草、矮牽牛等為代表的euAP3基因系列中[13-14]，AP3的表達模式較為固定，一般都在花的第2輪和第3輪表達，同PI類基因共同作用，決定花瓣和雄蕊的發(fā)育。

植物中的VIGS是近10年發(fā)展起來的快速鑒定植物基因功能的方法，VIGS發(fā)生在RNA水平，不改變植物本身的DNA，但是也有報道證實，利用TRV載體進行基因沉默時，其沉默的表型可以維持2年，并且可通過種子將沉默的表型遺傳給后代[15]。

本研究通過對辣椒PDS基因和PAP3基因片段克隆及序列分析，構(gòu)建了pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS重組病毒載體，經(jīng)測序檢測后，載體構(gòu)建正確可用，旨在為后續(xù)研究花器官花瓣和雄蕊發(fā)育的PAP3基因的功能提供實驗材料，為未來從分子層面調(diào)控辣椒育性偍供科學依據(jù)。

參考文獻

[1] Kaloshian I，Lange W H，Williamson V M. An aphidresistance locus is tightly linked to the nematode-resistance gene，Mi，in tomato[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（2）： 622-625.

[2] Lindbo J A，Silva-Rosales L，Proebsting W M，et al. Induction of a highly specific antiviral state in transgenic plants：implications for regulation of gene expression and virus resistance[J]. Plant Cell，1993，5（12）： 1749-1759.

[3] Covey S N，Al-Kaff N S. Plant DNA viruses and gene silencing[J]. Plant Mol Biol，2000，43（2）： 307-322.

[4] Robertson D. VIGS vectors for gene silencing： many targets，many tools[J]. Annu Rev Plant Biol，2004，55： 495-519.

[5] Liu Y，Schiff M，Dinesh-Kumar S P. Virus-induced gene silencing in tomato[J]. The Plant Journal，2002，31（6）： 777-786.

[6] Ratcliff F，Martin-Hernandez A M，Baulcombe D C. Technical advance： tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing[J]. The Plant Journal，2001，25（2）： 237-245.

[7] Fei Z，Tang X，Alba R M，et al. Comprehensive EST analysis of tomato and comparative genomics of fruit ripening[J]. The Plant Journal，2004，40（1）： 47-59.

[8] Preston J C，Hileman L C. SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN 1 initiate flowering in Antirrhinum majus through the activation of meristem identity genes[J]. The Plant Journal，2010，62（4）： 704-712.

[9] Shindo C，Lister C，Crevillen P，et al. Variation in the epigenetic silencing of FLC contributes to natural variation in Arabidopsis vernalization response[J]. Genes & development，2006，20（22）： 3079-3083.

[10] Cho Y，Lee Y P，Park B S，et al. Construction of a high-resolution linkage map of Rfd1，a restorer-of-fertility locus for cytoplasmic male sterility conferred by DCGMS cytoplasm in radish（Raphanus sativus L.）using synteny between radish and Arabidopsis genomes[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，125（3），467-477.

[11] Liu X L，Zhang S W，Duan J Q，et al. Mitochondrial genes atp6 and atp9 cloned and characterized from ramie （Boehmeria nivea （L.） Gaud.） and their relationship with cytoplasmic male sterility[J]. Molecular Breeding，2012，30（1）： 23-32.

[12] 郭 爽，沈火林，楊文才，等. 利用抑制消減雜交技術(shù)分離辣椒細胞質(zhì)雄性不育育性恢復相關(guān)EST[J]. 園藝學報，2009，36（10）： 1443-1449.

[13] Becker A，Theissen G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，29（3）： 464-489.

[14] Whipple C J，Ciceri P，Padilla C M，et al. Conservation of B-class floral homeotic gene function between maize and Arabidopsis[J]. Development，2004，131（24）： 6083-6091.

[15] Senthil-Kumar M，Mysore K S. Virus-induced gene silencing can persist for more than 2 years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato. Plant biotechnol J，2011，9（7）， 797-806.