白木香查爾酮合酶基因AsCHS1啟動子克隆及激素應答元件功能的初步鑒定

曹天駿等

摘 要 利用染色體步移法克隆了白木香查爾酮合成酶基因（AsCHS1）ATG上游1 082 bp的啟動子序列，該啟動子序列中AT含量高達69.03%，符合真核生物啟動子的序列特征。通過啟動子預測軟件分析可知，該序列的轉錄起始位點位于翻譯起始位點-65 bp處，并且其上游-25～30 bp區(qū)域存在TATA-box等典型的真核生物啟動子核心元件，同時含有一些順式作用元件如赤霉素應答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯應答元件CGTCA-motif、水楊酸應答元件TCA-element等激素調控元件，光應答元件BoxⅠ、G-Box、ACE，厭氧誘導元件ARE等。通過構建pC-1 082proAsCHS1植物表達載體，借助農桿菌將重組載體轉化到煙草葉片中。蛋白定量結果表明，該序列可以驅動GUS的表達，具有啟動子活性；脫落酸顯著增強該啟動子的活性，乙烯則顯著抑制該啟動子的活性。

關鍵詞 白木香；查爾酮合酶；啟動子；染色體步移；瞬時表達；GUS

中圖分類號 Q943.2 文獻標識碼 A

Abstract Based on the Genome Walker strategy，an approximately 1 082 bp sequence was obtained from the DNA of Aquilaria sinensis. Sequence analysis showed that this promoter region contained a TATA-box core element，a CAAT-box， and other cis-acting elements，including an GARE-motif，a TCA element，CGTCA-motif，G-Box，Box I，and a ARE element； these elements are involved in gibberellin responses，salicylic acid responses，methyl jasmonate responses，light response，respectively. The 1 082 bp promoter sequence was inserted in pCAMBIA1381Z vector to construct a fusion vector containing the promoter connected to the GUS gene. GUS quantitative analysis of transgenic Nicotiana benthamiana carrying the pC-1 082proAsCHS1 vector showed that the promoter was active in the leaves. It also showed high activity in the group treated by abscisic acid， while restrained activity in the group treated by ethylene. These results suggest that AsCHS1 may be regulated by this two phytohormones.

Key words Aquilaria sinensis；Chalcone synthases；Promoter；Genome Walker；Transient expression；β-Glucuronidase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.012

沉香是沉香屬植物，為含樹脂的木材，是中國、印度、日本及其他東南亞國家的名貴藥材和天然香料。白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg]是中國沉香的唯一基源植物[1]。白木香主要分布于中國的海南、廣東、廣西、福建、臺灣[2]。由于沉香價值高，長期以來白木香遭到掠奪式砍伐，其原始森林已經基本破壞殆盡。因此，白木香已被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（CITES）附錄Ⅱ[3]。

作為藥材，沉香可用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等[4]。對沉香的化學成分研究表明，其主要含有2類成分，即倍半萜類化合物和色酮類化合物[5]，而未經傷害誘導的白木香植物莖干部位則含有大量黃酮類化合物[6-8]。由于色酮類化合物和黃酮類化合物都含有苯并吡喃酮的結構[9]，因此推測沉香中色酮類化合物的產生可能與白木香植物中的黃酮類化合物具有相關性。

查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是合成黃酮類化合物的關鍵酶之一，催化香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成苯基苯乙烯酮。查爾酮合成酶基因在許多植物中已有克隆并進行了相關研究，如矮牽牛、雪蓮等[10]。查爾酮合成酶也作為苯丙氨酸代謝中的關鍵酶參與植物防御反應[11]。汪孟曦等[12]克隆了白木香查爾酮合成酶基因AsCHS1，AsCHS1在白木香莖干中可提前響應逆境脅迫。目前對白木香中黃酮類化合物的研究也只局限于化學成分的分離純化與結構鑒定，關于AsCHS1的表達調控機制尚不清楚。自然條件下沉香的形成所需時間很長，且含量低，探索提高沉香產量的方法對充分利用白木香資源具有重要意義[13]。

本研究利用染色體步移法克隆了AsCHS1啟動子，并利用瞬時表達系統(tǒng)對其功能進行初步鑒定，這為進一步研究AsCHS1的表達調控機制及闡明白木香受損傷后其類黃酮物質的累積情況奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

白木香莖組織采集于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所區(qū)內五年生白木香樹；本生煙草（Nicotiana benthamiana）種子、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株、pCAMBIA1381Z植物表達載體均由本實驗室保存；用于構建染色體步移文庫的試劑盒LA PCRTM in vitro Cloning Kit、pMD19-T載體、限制性內切酶、DNA聚合酶、T4連接酶和X-gal等均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自QIAGEN 公司；普通質粒小提試劑盒購自Real-Times公司。

1.2 方法

1.2.1 染色體步移文庫的構建 白木香DNA的提取參照趙翾等[13]的方法進行。染色體步移文庫的構建按照TaKaRa公司 LA PCRTM in vitro Cloning Kit使用說明書進行： （1）使用7種產生粘性末端的限制性內切酶（Sau3AI、HindⅢ、EcoRI、MflI、XbaⅠ、EcoT22I、BamHI）分別對白木香樹基因組DNA進行酶切消化，使用75%酒精對酶切消化后的DNA進行沉淀并純化； （2）把純化的DNA與試劑盒提供的接頭連接，構建成7種染色體步移文庫（Sau3AI庫、HindⅢ庫、EcoRI庫、MflI庫、XbaI庫、EcoT22I庫、BamhI庫）。

1.2.2 引物的設計 根據(jù)AsCHS1的序列（GenBank登錄號：EF103196.1）依次設計6條反向特異引物，并以試劑盒提供的引物C1、C2作為正向引物進行巢式PCR，設計的引物見表1。

1.2.3 AsCHS1啟動子的克隆 第1輪PCR反應：在7個0.25 mL的PCR管中分別加入7種DNA文庫0.5 μL，然后分別依次加入10×LA PCR 緩沖液Ⅱ 2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，引物C1 1 μL，引物S1 1 μL、LA Taq 0.5 μL，補水至20 μL；PCR反應程序：94 ℃預變性3 min， 94 ℃ 30 s，54 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。第2輪PCR反應：分別取第1輪PCR產物1 μL稀釋100倍作為第2輪PCR反應的模板，然后依次加入10×LA PCR緩沖液Ⅱ 2 μL、2.5 mmol/L的d NTP 2 μL，引物C2 1 μL，引物S2 1 μL、LA Taq 0.5 μL，總反應體系為20 μL；PCR反應程序：94 ℃預變性3 min， 94 ℃ 30 s，56 ℃ 2 min，72 ℃ 80 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。將PCR產物回收、純化后克隆至pMD19-T載體上并送北京諾賽生物技術有限公司測序。

1.2.6 植物表達載體轉化煙草 （1）將構建好的重組質粒、pCAMBIA1381Z質粒分別用電融合法導入農桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，挑取單菌落，使用pCAMBIA1381Z載體引物PCR驗證陽性克?。?（2）將驗證正確的單菌落擴大培養(yǎng)，直至至OD600=0.6～0.8，收集菌體后加懸浮液（MES+MgCl2+AS）靜置2 h，采用農桿菌介導的真空滲透法轉化本生煙草，于28 ℃光照氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h； （3）分別向其噴灑工作濃度為50 μmol/L的乙烯（ET）、赤霉素（GA）及100 μmol/L的脫落酸（ABA）、 茉莉酸甲酯（MeJA）、 水楊酸（SA）、吲哚乙酸（IAA）， 確保每片葉上均勻覆蓋各激素后，再次放入28 ℃光照氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，檢測GUS蛋白活性。

1.2.7 GUS活性檢測 （1）取0.1 g煙草樣品用液氮磨成粉末，將粉末轉移至1.5 mL離心管，加入400 μL蛋白抽提緩沖液[50 mmoL/L磷酸緩沖液（pH7.0）、0.1% Triton X-100、0.1% SDS、10 mmoL/L β-巰基乙醇、10 mmoL/L Na2-EDTA]，混勻，冰上靜置10 min，以12 000 r/min離心10 min后吸取上清，此上清即為總蛋白提取液；（2）采用Bradford[14]的方法測定總蛋白濃度，將總蛋白提取液與考馬斯亮藍溶液反應，用酶標儀測定其總蛋白濃度 （3）采用Jeferson等[15]的方法測定GUS蛋白活性，結果以所生成的4-MU的量與總蛋白含量和時間的比值表示（pmol/mg·min）。所有試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 染色體步移文庫的構建

白木香DNA經7種限制性內切酶酶切后，凝膠電泳均呈現(xiàn)彌散狀分布（圖2），表明DNA酶切充分?；厥彰盖泻蟮腄NA并將其與試劑盒提供的接頭連接，構建成染色體步移文庫。

2.2 AsCHS1啟動子的克隆

通過3次巢式PCR克隆到1 082 bp的啟動子（圖3），序列分析表明該啟動子有101 bp的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中AsCHS1的翻譯起始位點下游的序列完全一致，表明克隆到了轉錄起始位點上游1 082 bp的AsCHS1啟動子序列。

2.3 AsCHS1啟動子功能元件預測分析

對所獲得的1 082 bp AsCHS1啟動子序列進行功能元件預測分析表明，核心啟動子區(qū)域位于-106～-66 bp處，其可能的轉錄起始位點位于翻譯起始位點上游65 bp處。采用Plant CARE數(shù)據(jù)庫和植物順式元件查詢數(shù)據(jù)庫PLACE，對AsCHS1啟動子的順式作用元件進行分析，結果顯示（圖4）該序列具有啟動子核心序列TATA-box和增強子元件CAAT-box等典型的真核生物啟動子基本元件；激素相關元件如赤霉素應答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯應答元件CGTCA-motif以及水楊酸應答元件TCA-element等參與激素調控。同時還存在光應答元件BoxⅠ、G-Box、ACE（表2）。

2.4 植物表達載體的構建

對構建的pC-1082proAsCHS1載體質粒進行HindⅢ和SalⅠ的單酶切和雙酶切驗證，結果如圖5所示，單酶切結果線性化，雙酶切出現(xiàn)了插入的1 082 bp的片段，表明了載體質粒構建成功。

2.5 AsCHS1啟動子激素元件功能的初步鑒定

經GUS蛋白定量檢測后發(fā)現(xiàn)，與作為對照的水處理組及pCAMBIA1381Z空載體相比，插入該啟動子片段后能夠顯著地驅動載體上GUS蛋白的表達。激素處理結果表明，ABA對AsCHS1啟動子的活性有顯著的增強作用，ET對該啟動子的活性有顯著的抑制作用，而MeJA、SA、GA和IAA對AsCHS1啟動子的活性沒有明顯的影響（圖6）。

3 討論與結論

啟動子是基因的一個重要組成部分，控制基因表達的起始時間和表達的程度，啟動子順式作用元件的分析與挖掘對研究基因表達調控具有重要的作用[30]。本研究首次克隆了AsCHS1的啟動子，通過啟動子預測軟件分析可知，該序列的轉錄起始位點位于翻譯起始位點-65 bp處，并且其上游-25～-30 bp區(qū)域存在TATA-box等典型的真核生物啟動子核心元件，同時含有一些順式作用元件如赤霉素應答元件。本研究發(fā)現(xiàn)ABA對AsCHS1啟動子活性有增強功能，ET（乙烯）對該啟動子活性有抑制功能，這與啟動子功能元件預測結果不同，原因在于預測的結果是通過模式植物中已知的順式作用元件推斷的，但同種響應元件可能有多種不同的堿基序列，這些非特異的序列并未挖掘完全。

此外，查爾酮合成酶是苯丙氨酸代謝途徑中重要的限速酶，控制著植物中黃酮類物質和花青素的合成，其在白木香中的表達情況可能會對沉香的形成及品質造成影響。激素處理對植物體內黃酮類物質的累積具有促進效應，郭磊等[31]發(fā)現(xiàn)使用ABA處理桃果實后顯著促進了查爾酮合成酶基因（CHS）的轉錄水平，促進花色素苷的合成，從而促進了桃果實的著色。田曉艷等[32]也發(fā)現(xiàn)脫落酸對南果梨的色素累積起作用。而關于ET對查爾酮合成酶表達的影響則很少有報道，乙烯對果實著色的促進作用主要體現(xiàn)在花青素合成代謝途徑的支路上[33-34]。因此本研究為通過激素處理來提高白木香中黃酮的含量提供了參考依據(jù)。

通過改變植物次生代謝產物合成途徑中的關鍵酶基因的表達來提高次生代謝物的產量已有報道[35-36]，如在青蒿中過量表達法尼基焦磷酸合成酶基因，青蒿素的含量與對照相比提高了4倍[37-38]；健康的白木香植株并不產生沉香，只有通過自然因素（雷劈、火燒、蟲蛀等）或人為因素（砍傷、打洞、接菌等）的作用，沉香才會在植物中逐漸積累形成。通過對白木香AsCHS1啟動子激素元件的深入研究，將通過激素刺激等直接或間接提高AsCHS1的表達，從而摸索出能夠產生更多類型豐富的黃酮類次生代謝產物的方法，為探索白木香中黃酮類物質產生和累積的原理提供依據(jù)。同時，在啟動子水平上，挖掘逆境下白木香查爾酮合成酶參與防御反應的高表達機理，可為闡明白木香莖干部位細胞響應傷害脅迫和黃酮類物質累積的分子機理奠定基礎。

參考文獻

[1] 張 爭， 楊 云， 魏建和， 等. 白木香結香機制研究進展及其防御反應誘導結香假說[J]. 中草藥， 2010 ， 41（1）： 156-159.

[2] 梅文莉， 楊德蘭， 左文健， 等. 奇楠沉香中2-（2-苯乙基）色酮的GC-MS分析鑒定[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（9）： 1 819-1 824.

[3] CITES. Amendments to AppendixⅠandⅡof CITES， In Proceedings of Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties[C]. Bangkok， Thailand： 2004， 2-14.

[4] 中華人民共和國藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M] . 北京： 化學工業(yè)出版社， 2010： 172.

[5] Naef R. The volatile and semi-volatile constituents of agarwood， the infected heartwood of Aquilaria species： a review[J]. Flavour Fragr J， 2011， 26（2）： 73-87.

[6] 李 薇， 梅文莉， 王 昊， 等. 白木香樹干的化學成分研究[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（17）： 2 826-2 831.

[7] 陳 東， 畢 丹， 宋月林， 等. 白木香中的黃酮類成分（英文）[J]. 中國天然藥物， 2012， 10（4）： 287-291..

[8] 彭 可， 梅文莉， 吳 嬌， 等. 白木香樹干中的黃酮類成分[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2010， 18（1）： 97-100.

[9] 戚樹源， 林立東， 胡厚才. 白木香中色酮類化合物的形成[J]. 中草藥， 2000， 31（9）： 658-659.

[10] 蔣 明， 曹家樹. 查爾酮合成酶基因[J]. 細胞生物學雜志， 2007， 29（4）： 525-529.

[11] 廖靖軍， 安成才， 吳 思， 等. 查爾酮合酶基因在植物防御反應中的調控作用[J]. 北京大學學報： 自然科學版， 2000， 36（4）： 566-575.

[12] 汪孟曦， 李文蘭， 張 爭， 等. 白木香查爾酮合酶（AsCHS1） 基因的克隆和生物信息學分析[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（2）： 149-153.

[13] 趙 翾， 趙樹進. 白木香基因組DNA提取方法研究[J]. 河南工業(yè)大學學報： 自然科學版， 2006， 27（3）： 13-16.

[14] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry， 1976， 72（1-2）： 248-254.

[15] Jefferson R A， Kavanagh T A， Bevan M W. GUS fusions： beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J]. The EMBO Journal， 1987， 6（13）： 3 901-3 907.

[16] Simpson S D， Nakashima K， Narusaka Y， et al. Two different novel cis-acting elements of erd1， a clpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress and dar-induced senescence[J]. The Plant Journal， 2003， 33（2）： 259-270.

[17] Geffers R， Sell S， Cerff R， et al. The TATA box and a Myb binding site are essential for anaerobic expression of a maize GapC4 minimal promoter in tobacco[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Gene Structure and Expression， 2001， 1 521（1）： 120-125.

[18] Wang X J， Li W M， Tang Q L， et al. Function Deletion Analysis of Light-induced Gacab Promoter from Gossypium arboreum in Transgenic Tobacco[J]. Acta Agronomica Sinica， 2009， 35（6）： 1 006-1 012.

[19] Shirsat A， Wilford N， Croy R， et al. Sequences responsible for the tissue specific promoter activity of a pea legumin gene in tobacco[J]. Molecular and General Genetics MGG， 1989， 215（2）： 326-331.

[20] Boter M， Ruíz-Rivero O， Abdeen A， et al. Conserved MYC transcription factors play a key role in jasmonate signaling both in tomato and Arabidopsis[J]. Genes & Development， 2004， 18（13）： 1 577-1 591.

[21] Wang Y， Liu G J， Yan X F， et al. MeJA-inducible expression of the heterologous JAZ2 promoter from Arabidopsis in Populus trichocarpa protoplasts[J]. Journal of Plant Diseases and Protection， 2011， 118（2）： 69-74.

[22] Bastian R， Dawe A， Meier S， et al. Gibberelic acid and cGMP-dependent transcriptional regulation in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Signaling & Behavior， 2010， 5（3）： 224-232.

[23] Urao T， Yamaguchi-Shinozaki K， Urao S， et al. An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence[J]. The Plant Cell Online， 1993， 5（11）：1 529-1 539.

[24]Tjaden G，Edwards J W，Coruzzi G M. Cis elements and trans-acting factors affecting regulation of a nonphotosynthetic light-regulated gene for chloroplast glutamine synthetase[J]. Plant physiology， 1995， 108（3）：1 109-1 117.

[25] Fauteux F， Stromvik M V. Seed storage protein gene promoters contain conserved DNA motifs in Brassicaceae， Fabaceae and Poaceae[J]. BMC Plant Biology， 2009， 9（1）： 126.

[26] Cohen J B， Effron K， Rechavi G， et al. Simple DNA sequences in homologous flanking regions near immunoglobulin VH genes： a role in gene interaction？[J]. Nucleic Acids Research， 1982， 10（11）： 3 353-3 370.

[27] Piechulla B， Merforth N， Rudolph B. Identification of tomato Lhc promoter regions necessary for circadian expression[J]. Plant Molecular Biology， 1998， 38（4）： 655-662.

[28] Xu M， Zhang L， Huang Z， et al. Cloning and sequence analysis of endosperm specific promoter from rice[J]. Biotechnology， 2010， 1： 4.

[29] Allen R D， Bernier F， Lessard P A， et al. Nuclear factors interact with a soybean beta-conglycinin enhancer[J]. The Plant Cell Online， 1989， 1（6）： 623-631.

[30] Yang Y N， Li R G， Qi M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves[J]. The Plant Journal， 2000， 22（6）： 543-551.

[31] 郭 磊， 蔡志翔， 張斌斌， 等. 外源脫落酸對桃果實著色及相關基因表達的影響[J]. 西北植物學報， 2013， 33（9）： 1 750-1 755.

[32] 田曉艷， 劉延吉. 脫落酸對南果梨色素及部分合成關鍵酶的影響[J]. 北方園藝， 2009（12）： 155-156.

[33] 劉 金， 魏景立， 劉美艷， 等. 早熟蘋果花青苷積累與其相關酶活性及乙烯生成之間的關系[J]. 園藝學報， 2012， 39（7）： 1 235-1 242.

[34] 王傳增， 張艷敏， 徐玉亭， 等. 蘋果紅色芽變香氣組分及脂肪酸代謝相關酶活性分析[J]. 園藝學報， 2012， 39（12）： 2 447-2 456.

[35] 王 穎， 麥維軍， 梁承鄴， 等. 高等植物啟動子的研究進展[J]. 西北植物學報， 2003， 23（11）： 2 040-2 048.

[36] 郭 冬， 李輝亮， 彭世清. 巴西橡膠樹法尼基焦磷酸合酶基因5'調控序列的克隆及功能初步鑒定[J]. 熱帶農業(yè)工程， 2010， 34（6）： 31-36.

[37] Chen D H， Liu C J， Ye H C， et al. Ri-mediated transformation of Artemisia annua with a recombinant farnesyl diphosphate synthase gene for artemisinin production[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 1999， 57（3）： 157-162.

[38] Daudonnet S， Karst F， Tourte Y. Expression of the farnesyldiphosphate synthase gene of Saccharomyces cerevisiae in tobacco[J]. Molecular Breeding， 1997， 3（2）： 137-145.