冷凍對哺乳動物胚胎發(fā)育分子調(diào)控的影響

寧效斌　蘇雷

摘要 綜述了幾種與哺乳動物胚胎發(fā)育分子調(diào)控相關(guān)的重要蛋白質(zhì)以及超低溫冷凍保存在分子水平上對胚胎發(fā)育的影響。

關(guān)鍵詞 哺乳動物；冷凍；胚胎發(fā)育；分子調(diào)控

中圖分類號 S813.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03926-04

Abstract Several essential kinds of proteins related to the molecular regulation of mammalian embryonic development were reviewed， as well as effects of cryopreservation on embryonic development at the molecular level.

Key words Mammalian； Cryopreservation； Embryonic development； Molecular regulation

近年來，由于胚胎冷凍技術(shù)的不斷進步，已成為一項成熟的胚胎工程技術(shù)，甚至克隆胚胎通過冷凍技術(shù)也獲得了相應(yīng)的后代[1]。盡管如此，胚胎冷凍的機理尚不十分清楚。除了冷凍保護劑的毒性、冷凍損傷、細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成等因素對胚胎產(chǎn)生影響外，冷凍本身可使胚胎內(nèi)的一些固有結(jié)構(gòu)、物質(zhì)（如mRNA）發(fā)生改變[2]，嚴(yán)重影響胚胎的存活率。冷凍/解凍后胚胎的基因表達(dá)分析可能是一種有效揭示這類胚胎早期發(fā)育分子機制的有效途徑。

1 哺乳動物胚胎發(fā)育過程中相關(guān)的重要蛋白質(zhì)

在哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的變化錯綜復(fù)雜。早期胚胎的發(fā)育是由卵母細(xì)胞中的一些因子來調(diào)控的，這些因子是在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中合成和存儲的。在胚胎基因組活性激活以前，胚胎的發(fā)育是由這些因子來調(diào)節(jié)的。胚胎形成后，基因組的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)才被啟動，胚胎的發(fā)育逐漸由自身合成的物質(zhì)來調(diào)控。

1.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase）

目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts），根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的差異分為兩大類：分別以Dnmt1和Dnmt3為代表。前者主要用于保持子代細(xì)胞與母細(xì)胞相同的DNA特異性甲基化模式，參與甲基化狀態(tài)的維持，也是非CpG位點從頭甲基化所必需的，并與甲基化狀態(tài)的延伸有關(guān)；后者包括Dnmt3a、Dnmt3b以及Dnmt3L等，主要負(fù)責(zé)建立胚胎發(fā)育分化過程中的組織特異性甲基化模式，是主要的從頭甲基化酶[3]。Dnmt對早期胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要[4-5]。

在不同的序列類別中，哺乳動物的DNA甲基化對基因的轉(zhuǎn)錄活性是一種主要和關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)節(jié)機制（Epigenetic regulatory mechanism）。在小鼠的生殖細(xì)胞發(fā)育過程中，從頭甲基化只在非常有限的時期發(fā)生，說明Dnmt3a和Dnmt3b在限制功能的表達(dá)有一定的機制作用[6]。分析Dnmt3a還能確定表觀遺傳重編程（Epigenetic reprogramming）的潛能差異[7]。Dnmtl蛋白在胚胎發(fā)育時建立組織特異性甲基化模式方面發(fā)揮重要作用，在正常發(fā)育的胚胎中維持一種正確的DNA甲基化模式需要Dnmt1地正確表達(dá)和發(fā)育階段特定的翻譯后調(diào)節(jié)[8]。在綿羊的生發(fā)泡（Germinal vesicle，GV）期卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育過程中，GV期卵中Dnmt1 mRNA含量最高，從2-細(xì)胞胚胎開始直至囊胚，Dnmt1基因的mRNA含量顯著降低，Dnmt1的含量在不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞和胚胎中存在動態(tài)變化，這對卵子生長和胚胎發(fā)育具有重要意義[9]。

1.2 縫隙連接蛋白（Connexins）

此類蛋白是細(xì)胞間建立縫隙連接所必需的。在研究胚胎致密化的分子調(diào)控時發(fā)現(xiàn)，牛體內(nèi)胚胎在桑椹胚期可檢測到connexin43（Cx43）的表達(dá)[10]，體外生產(chǎn)的牛胚胎有的不表達(dá)這類蛋白，導(dǎo)致胚胎不能致密化，無法形成桑椹胚[11]，從而降低胚胎潛能性。在綿羊卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過程中，connexin26、connexin32、Connexin43及Connexin45在各個時期均有表達(dá)，Cx43在未成熟卵母細(xì)胞、體外成熟（IVM）卵母細(xì)胞、2-細(xì)胞中表達(dá)量較低，?？芭吆湍遗咂跁r達(dá)到最高；而Cx45在8-細(xì)胞期表達(dá)量最高，未成熟卵母細(xì)胞、IVM卵母細(xì)胞和2-細(xì)胞期的表達(dá)量低于8-細(xì)胞期，?？芭吆湍遗咂谂咛サ谋磉_(dá)量稍低于8-細(xì)胞期；Cx43和Cx45蛋白在體內(nèi)受精胚胎中轉(zhuǎn)錄子的含量高于體外受精（IVF）胚胎[12]。Cx43基因在水牛IVM卵母細(xì)胞中表達(dá)量最高，顯著高于IVF 2-細(xì)胞期胚胎、桑椹期胚胎、囊胚期胚胎[13]。

1.3 上皮鈣調(diào)素蛋白（Epithelial cadherin，E-cadherin）

調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間粘連的重要蛋白，其功能的發(fā)揮需要Ca2+的參與。在研究胚胎致密化及細(xì)胞間連接的分子調(diào)控時發(fā)現(xiàn)，E-cadherin是桑椹胚外層細(xì)胞或囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞間緊密連接復(fù)合體形成的主導(dǎo)因子，胚胎致密化或囊胚的形成主要依賴于此蛋白。如果這種蛋白質(zhì)缺失或其功能達(dá)不到正常發(fā)揮，胚胎在桑椹胚或囊胚期的發(fā)育就會出現(xiàn)異常[14]，導(dǎo)致胚胎不能進入下一發(fā)育階段。在水牛IVM卵母細(xì)胞及IVF早期胚胎發(fā)育過程中，E-cad基因在各個時期中mRNA表達(dá)無顯著差異[13]。

1.4 緊密連接蛋白（Tight junction protein）

研究表明外層細(xì)胞間的緊密連接至少是由5種蛋白構(gòu)成的復(fù)合體，它們分別是ZO-1、ZO-2、7H6、扣帶蛋白和封閉蛋白。封閉蛋白是核心成員之一，它與ZO-1和扣帶蛋白結(jié)合在一起構(gòu)成細(xì)胞外連接和細(xì)胞內(nèi)骨架間的結(jié)合鏈，使胚胎內(nèi)細(xì)胞之間緊密連接起來。ZO-1是構(gòu)成細(xì)胞間連接的主要成分，在小鼠和牛胚胎外層細(xì)胞的連接部位，呈點狀分布[14]。外層細(xì)胞的緊密連接在胚胎發(fā)育過程中具有重要功能：調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞間的物質(zhì)運輸；維持外層細(xì)胞的極性；維持Na/K-ATP酶的極性分布；維持半透膜的穩(wěn)定性，防止過度膨脹[15]。

1.5 干擾素-τ（Interferonτ，IFN-τ）

IFN-τ是一種孕體分泌蛋白，在反芻動物的整個妊娠失敗中早期胚胎死亡占有很大的比例，它在很大程度上是由母體妊娠識別失敗造成的。IFN-τ是由反芻動物孕體附植時發(fā)出的特有的妊娠識別信號，是建立母體妊娠識別的一種主要因子。另外，IFN-τ在免疫方面也起著重要作用。

牛胚胎在體外生長發(fā)育過程中，IFN-τ在胚胎發(fā)育的各個時期均有表達(dá)，除在未成熟卵母細(xì)胞中呈高表達(dá)外，其余都呈低表達(dá)，這與其維持黃體功能密切相關(guān)[16]。Rho G J等也研究表明IFN-τ在胚胎發(fā)育的各個時期均有表達(dá)[17]。然而，也有研究表明IFN-τ mRNA在牛IVF第4天的16-細(xì)胞胚胎期、體細(xì)胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）第5天的桑椹期、孤雌激活（Parthenogenetic activation，PA）第6天的早期囊胚期首次表達(dá)[18]。

1.6 熱休克蛋白（Heat shock proteins）

哺乳動物中廣泛存在一類熱應(yīng)急蛋白質(zhì)。當(dāng)有機體暴露于高溫時，就會由熱激發(fā)合成此種蛋白，來保護有機體自身。許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白的大小，熱休克蛋白共分為5類，分別為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 以及小分子熱休克蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs）。

在牛胚胎體外生長發(fā)育過程中，Hsp70在胚胎發(fā)育的各個時期均有表達(dá)，但表達(dá)量稍低[16]。1999年C.WRENZYCKI等在對牛體外胚胎進行培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)添加血清的培養(yǎng)液獲得的早期胚胎比添加聚乙烯醇（PVA）的培養(yǎng)液獲得的早期胚胎的潛能性更高，差異顯著，同時，在2個試驗組中均發(fā)現(xiàn)Hsp70持續(xù)表達(dá)，且添加血清的比添加PVA的試驗組顯著增加[19]，表明Hsp70的表達(dá)量與體外生產(chǎn)的胚胎質(zhì)量成正相關(guān)。Mishra A等研究也發(fā)現(xiàn)Hsp70在胚胎發(fā)育的各個時期均有表達(dá)，但在發(fā)育緩慢的胚胎中Hsp70的表達(dá)量較少，8-16細(xì)胞期后幾乎不表達(dá)；它與溫度緊密相關(guān)，隨著溫度的增加，Hsp70 mRNA的表達(dá)量也相應(yīng)提高，說明Hsp70 mRNA的表達(dá)可能作為胚胎對溫度敏感性的靶標(biāo)[20]。

1.7 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（Glucose transporters）

此類蛋白與細(xì)胞代謝有關(guān)。2002年Knijn等研究表明牛體內(nèi)受精獲得的囊胚期胚胎

Glut-1表達(dá)量顯著高于體外獲得的囊胚期胚胎[21]。在牛胚胎體外生長發(fā)育過程中，Glut-1基因一直持續(xù)高表達(dá)，這與體外培養(yǎng)的胚胎生長發(fā)育狀況密切相關(guān)[16]。

Rajhans R等研究也發(fā)現(xiàn)Glut-1在水牛體外生產(chǎn)胚胎發(fā)育的各個時期均有表達(dá)，但在發(fā)育緩慢的胚胎中Glut-1的表達(dá)量較少，8-16細(xì)胞期后幾乎不表達(dá)，說明Glut-1的表達(dá)與胚胎發(fā)育阻滯密切相關(guān)[22]。2010年J. Zaraza等研究表明Glut-3在8-細(xì)胞、16-細(xì)胞時期表達(dá)水平低，囊胚期表達(dá)量增加，說明葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白對囊胚期胚胎是非常必需的[23]。哺乳動物附植前胚胎能輕易地吸收及利用葡萄糖，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮了很大作用。另外，有研究發(fā)現(xiàn)Glut1、Glut3、Glut8在胚胎發(fā)育早期各個時期均有表達(dá)，而Glut2僅在囊胚期開始表達(dá)[24]。

1.8 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。細(xì)胞凋亡是個體發(fā)育過程中由一系列蛋白調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程。其中，bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡中相互聯(lián)系，相互作用，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可誘導(dǎo)小鼠囊胚細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)，其表達(dá)在內(nèi)細(xì)胞群尤其明顯，并伴有囊胚細(xì)胞數(shù)目明顯減少，從而證實高濃度葡萄糖對胚胎的毒性作用在胚胎著床前已經(jīng)發(fā)生[25]。Bcl-2基因通過阻止抑制細(xì)胞凋亡直接調(diào)控正常免疫器官的發(fā)育， 在淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中Bcl-2是免疫細(xì)胞亞型選擇的重要調(diào)節(jié)物[26]。在小鼠體內(nèi)早期胚胎發(fā)育過程中，隨著胚胎細(xì)胞數(shù)目的增加，凋亡比率逐漸增大；Bax表達(dá)量在整個過程中基本不變，Bcl-2表達(dá)量逐漸上調(diào)，Bak、Bcl-xl的表達(dá)量逐漸降低[27]。2008年H.Y.Jang等用牛輸卵管上皮細(xì)胞（BOEC）與胚胎共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)不管是共培養(yǎng)獲得的早期胚胎還是單獨培養(yǎng)得到的早期胚胎，均檢測到Caspase-3和Bax基因，然而p53基因只在與BOEC共培養(yǎng)的胚胎中被檢測到[28]。2006年Boon Chin Heng等研究表明細(xì)胞凋亡而不是細(xì)胞壞死是降低冷凍/解凍后的人類胚胎干細(xì)胞（hES）生存能力的主要機制，此hES是用傳統(tǒng)冷凍法冷凍保存的[29]。

2 超低溫冷凍對胚胎的分子調(diào)控研究現(xiàn)狀

2007年Dhali等采用微滴玻璃化冷凍法（Droplet vitrification）冷凍小鼠囊胚期胚胎時，發(fā)現(xiàn)冷凍后的胚胎與鮮胚相比，Bax、Bcl-2和p53 3個基因轉(zhuǎn)錄物相對量均下降，同時凍胚的發(fā)育潛能力比鮮胚低，表明此3種基因轉(zhuǎn)錄物與胚胎發(fā)育潛力有很大的聯(lián)系[30]。然而，2010年Kuzmany等研究牛胚胎的冷凍時發(fā)現(xiàn)，與冷凍前的胚胎相比，冷凍后胚胎中的Bax及Bcl-XL轉(zhuǎn)錄物相對量均顯著增加，說明超低溫冷凍對胚胎內(nèi)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄物同樣有影響[31]。2011年Anna Kuzmany等也發(fā)現(xiàn)，與體外培養(yǎng)獲得的牛鮮胚相比，冷凍后囊胚中的Bax、Bcl-XL基因表達(dá)顯著上調(diào)（Up-regulation），結(jié)果表明冷凍后的胚胎已經(jīng)開啟mRNA合成，為下一步胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備[32]。2012年Lisa Shaw等研究超低溫冷凍對人早期胚胎的基因表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，與鮮胚相比，冷凍組的4-細(xì)胞胚胎與囊胚Bax表達(dá)顯著上調(diào)[33]。

2006年Sae Young Park等用2種不同玻璃化冷凍法（0.25 ml麥管開放式拉管法和最小容積法）對牛囊胚進行冷凍試驗，發(fā)現(xiàn)survivin、Fas、caspase-3及Hsp70的表達(dá)水平較非冷凍組顯著增加，表明冷凍程序可能導(dǎo)致胚胎損傷，從而引起DNA破裂且細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄物也隨之增加，最終降低了冷凍胚胎的發(fā)育潛能[34]。2010年Kuzmany等研究也表明，與冷凍前相比，冷凍后擴張囊胚（Reexpanded blastocysts）中的HSPA1A mRNA顯著增加[31]；與牛IVP正常胚胎相比，玻璃化法和傳統(tǒng)冷凍法使孵化囊胚中的HSP70轉(zhuǎn)錄物的相對量受到明顯影響，揭示不同冷凍方法對牛孵化囊胚中的重要基因表達(dá)量具有很大影響[35]。 2011年Stinshoff等用傳統(tǒng)冷凍法與玻璃化冷凍法對牛擴張囊胚期胚胎進行冷凍保存時，發(fā)現(xiàn)用玻璃化法的HSPA1A與鮮胚組存在顯著差異，用傳統(tǒng)冷凍法的HSPA1A與鮮胚組相比也存在顯著差異，而玻璃化法（Vitrification）比傳統(tǒng)冷凍法（Conventional slow freezing）更適合于保存胚胎[36]。2011年Anna Kuzmany等研究時發(fā)現(xiàn)，與體外培養(yǎng)獲得的牛囊胚期鮮胚相比，冷凍后的囊胚中Hsp 1A的轉(zhuǎn)錄物顯著地上調(diào)[32]。

與 IVP 的正常牛孵化囊胚相比，用玻璃化法和傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的孵化囊胚中GLUT-1轉(zhuǎn)錄物的相對量受到明顯影響，用傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的孵化囊胚中的GLUT-3 mRNA量也受到顯著影響，結(jié)果表明冷凍處理過程本身及冷凍方法對牛孵化囊胚中的重要基因的表達(dá)有很大影響[35]。2011年Stinshoff等發(fā)現(xiàn)用玻璃化法冷凍后的擴張囊胚中Glut-1表達(dá)豐度與鮮胚存在顯著差異，用傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的Glut-1、 Glut-3與鮮胚組也存在顯著差異，揭示玻璃化法比傳統(tǒng)冷凍法更適合于保存胚胎[36]。

在研究胚胎致密化及細(xì)胞間連接的分子調(diào)控時發(fā)現(xiàn)，與 IVP 正常牛孵化囊胚相比，用玻璃化法和傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的孵化囊胚中ZO-1轉(zhuǎn)錄物的相對量明顯受到影響，同時發(fā)育潛能也降低[35]。與正常鮮胚相比，傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的孵化囊胚中DNMT3a mRNA量受到顯著影響[35]。2011年Stinshoff等發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的胚胎中DNMT3a mRNA相對豐度與鮮胚組相比也存在顯著差異[36]。對干擾素的研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的牛孵化囊胚中的IFN-τ mRNA量受到顯著影響[35]。2011年Stinshoff等也發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)冷凍法冷凍后的牛胚胎IFN-τ mRNA量與鮮胚對照組存在顯著差異，此外玻璃化法與傳統(tǒng)冷凍法相比IFNT2基因轉(zhuǎn)錄物也存在顯著差異[36]。

3 小結(jié)

綜上所述，超低溫冷凍保存對哺乳動物體外生產(chǎn)胚胎質(zhì)量的影響在分子水平上清楚地得到反映。在胚胎冷凍過程中，研究表明盡可能保證及維持早期胚胎基因組的正常表達(dá)，凍融胚胎的潛能性就可以得到提高，從而可以依此判斷冷凍方法的可行性及高效性。從分子水平上來分析胚胎的質(zhì)量，可為拯救瀕危動物和開發(fā)利用珍稀動物及解決基因克隆的低效率問題提供技術(shù)參考。隨著分子檢測技術(shù)的不斷提高，胚胎質(zhì)量的鑒定也會更加方便準(zhǔn)確，胚胎冷凍損傷機制也將得到進一步闡釋。

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