嗜水氣單胞菌的分離與16SrDNA鑒定

孫亭亭等

摘要 [目的]分離并鑒定魚嗜水氣單胞菌，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析。[方法]從云南某魚場采集發(fā)病魚的病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離與培養(yǎng)，并對分離菌株進(jìn)行初步鑒定、16S rDNA鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。[結(jié)果]分離培養(yǎng)到1株細(xì)菌，命名為Ah1305。經(jīng)表型鑒定、生化試驗及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為嗜水氣單胞菌。[結(jié)論]該研究可為快捷、準(zhǔn)確檢測魚嗜水氣單胞引起的疾病提供參考。

關(guān)鍵詞 嗜水氣單胞菌；分離鑒定；16S rDNA

中圖分類號 S182；Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03907-04

Abstract [Objective] The aim was to isolate and identify Aeromonas hydrophila and establish the phylogeny. [Method] Lesion tissue of fish was collected from a certain farm in Yunnan Province， and then the isolated strain was identified by preliminary identification， 16S rDNA identification and phylogenetic analysis. [Result] The bacteria were isolated and named as Ah1305. Through the morphological identification， biochemical test and 16S rDNA phylogeny analysis， it was identified as Aeromonas hydrophila. [Conclusion] The study can provide reference for quick and accurately test the disease caused by Aeromonas hydrophila.

Key words Aeromonas hydrophila； Isolation and identification； 16S rDNA

致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于氣單胞菌科（Aermonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），是革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓，直或略彎，單個或成雙排列，有極端單鞭毛，固體培養(yǎng)基上有周鞭毛，無莢膜，不形成芽孢，最適生長溫度為28 ℃。嗜水氣單胞菌普遍存在于淡水、海水、污泥、淤泥以及土壤中，是一種人畜共患病的病原?；疾◆~出現(xiàn)爛尾、鰭充血，導(dǎo)致出血性敗血癥和流行性潰瘍綜合癥（EUS）等癥狀[1-2]，近些年來有大量的報道表明嗜水氣單胞菌還可以引發(fā)人類的腹瀉、中毒病、外傷性感染以及敗血癥等病癥[3]，其致病作用已引起公眾的關(guān)注，該菌在國外被作為腹瀉病原菌進(jìn)行檢測[4-5]。致病菌株除感染魚及人類以外，還可以感染多種動物（如兩棲類、爬行類、鳥類[6]等），給養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生帶來了巨大損失。

筆者從云南某發(fā)病魚場送檢病料中分離到1株細(xì)菌，并對其進(jìn)行表型鑒定及16S rDNA鑒定，以期為魚場該病的檢測與防治提供科學(xué)依據(jù)[7-11]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

病料。采集云南省某魚場發(fā)病魚。將發(fā)病癥狀明顯的魚無菌解剖，取病變明顯的肝臟、脾臟及肌肉，4 ℃下保存。

1.1.2

培養(yǎng)基。TSA培養(yǎng)基，購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。糖類發(fā)酵等生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司。血液瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.3

主要試劑及儀器。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP2001）、多功能DNA純化回收試劑盒（DP1501），購自BIOTEKE公司。TaKaRa rTaq DNA酶、DL2000 Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司。凝膠成像儀、PCR擴(kuò)增儀，購自BIO-RAD公司，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1

分離培養(yǎng)。將病魚體表消毒，無菌取病變組織，剪碎研磨。用無菌生理鹽水對病料進(jìn)行10倍稀釋，分別接種于TSA培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)，挑取灰白色發(fā)生溶血的可疑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。將染色中有陰性短桿菌的菌落在TSA培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基上分離與純化。

1.2.2

形態(tài)觀察。將分離純化后的細(xì)菌按照常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.3

生理生化試驗。將純培養(yǎng)的分離菌接種于生化培養(yǎng)基，進(jìn)行各種糖發(fā)酵試驗、精氨酸雙水解酶試驗、硫化氫試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗，28 ℃下培養(yǎng)24～48 h，記錄培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.4

分子生物學(xué)鑒定。

（1）引物設(shè)計。參照GenBank已發(fā)表的16S rDNA序列設(shè)計1對引物，上游引物：27F（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3），下游引物：1492R（5GGTTACCTTGTTACGACTT3）。引物由上海生工生物技術(shù)工程有限公司合成。

（2）制備模板：將分離菌株用TSA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書步驟操作，提取細(xì)菌總DNA。

（3）PCR反應(yīng)體系：TaKaRa rTaq（5 U/μl） 0.5 μl、10×PCR Buffer 3 μl、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μl、上游引物0.5 μl（10 pmol/L）、下游引物0.5 μl（10 pmol/L）、模板DNA 2 μl（50 ng）、滅菌雙蒸水21 μl、共30 μl。

PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃保存，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。

按照DNA純化（膠回收）試劑盒說明書操作步驟對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并送交華大基因測序。

1.2.5

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。用BLAST將分離株的16S rDNA測序結(jié)果與GenBank中登錄的序列進(jìn)行比對，并選取19株作為參比序列。將分離株序列與參比序列使用軟件DNAMAN進(jìn)行同源性分析，計算同源性數(shù)值。使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析分離株與參比株的親緣關(guān)系，鑒定分離株的種屬。參比序列的名稱、登錄號、登錄時間、分離來源及分離地區(qū)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

通過細(xì)菌分離，得到1株細(xì)菌，命名為Ah1305。在TSA固體培養(yǎng)基上，形成半透明、圓形、中央凸起、邊緣光滑的小菌落，直徑在1 mm左右。在血液瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色的菌落，產(chǎn)生β型溶血圈（圖1）。

2.2 細(xì)菌形態(tài)

3 討論

在臨床上魚類的細(xì)菌病中，很多具有共同的癥狀（如體表充血、發(fā)紅、潰爛、腹部膨大、腹水等），只依靠臨床癥狀來判斷及治療有很大盲目性，需要通過實驗室診斷才能確診[12]。實驗室鑒定魚類細(xì)菌性疾病病原的方法有很多，主要包括生理生化特性鑒定技術(shù)（如用ATB細(xì)菌鑒定儀）[13-14] 、免疫學(xué)診斷技術(shù)（如間接ELISA）[15-16]、分子生物學(xué)方法[17-20]（如LAMP）[21-22]等。PCR檢測方法簡便快捷，已被較多應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的快速檢測。檢測的目的基因也有多種，如溶血素基因[23-24]、氣溶素基因[25]、絲氨酸蛋白酶基因[26]、16S rDNA[27-28]等。

以16S rDNA為目的基因的PCR鑒定方法最為成熟，也取得了較顯著的成果。與表形鑒定、生理生化鑒定等傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法相比，該方法操作簡便，省時，且避免了傳統(tǒng)生化試驗的不穩(wěn)定性。與針對其他基因的PCR鑒定方法相比，16S rDNA基因具有高度保守性的特點，穩(wěn)定性好，可靠性高。對于混合感染的病例，可做到一次檢測多種病原菌。該方法方便快捷，成本較低，準(zhǔn)確性高，對于癥狀相似的疾病能夠做到準(zhǔn)確、快速鑒定病原菌，從而指導(dǎo)臨床治療，避免因誤診而造成的損失。

參考文獻(xiàn)

[1] GORDEN R W，HAZEN T C，ESCH G W，et al.Isolation of Aeromonas hydrophila from Ameirican alligator，Alligator mississippiensis[J].J Wildlife Dis，1979，15（2）：239-243.

[2] HOSSAIN M.Isolation of pathogenic bacteria from the skin ulcerous symptomatic gourami （Colisa lalia） through 16S rDNA analysis[J].Univer J Zool，Rajshahi Univer，2008，27（12）：21-24.

[3] 葉方友，江夏明，王琳娜.一起嗜水氣單胞菌感染導(dǎo)致群體性腹瀉的調(diào)查[J].中華流行病學(xué)雜志，2004，25（5）：406.

[4] 胡萌，潘子豪，陸承平，等.嗜水氣單胞菌流行菌株的生物學(xué)特性[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（05）：441-445.

[5] JANDA J M，ABBOTT S L.The genus Aeromonas：taxonomy，pathogenicity，and infection[J].Clin Microbiol Rev，2010，23（1）：35-73.

[6] 冷闖，鄧舜洲，張文波，等.中華鱉致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（2）：124-129.

[7] 陳雪，李太元，常巧城，等.林蛙紅腿病PCR診斷方法的建立[J].獸醫(yī)科技報，2009（5）：82-83.

[8] 韋信賢，楊先樂，童桂香，等.四重PCR檢測致病性嗜水氣單胞菌[J].中國人獸共患病學(xué)報，2013，29（6）：587-593.

[9] MENG S，BAI XM，WANG Y，et al.Novel triplex realtime Taq-Man PCR assay for the detection of Aeromonas hydrophila[J].Chin J Zoonoses，2012，28（3）：217-222.

[10] Jumpstart Consortium Human Microbiome Project Data Generation Working Group.Evaluation of 16S rDNAbased community profiling for human microbiome research[J].PLOS One，2012，7（6）：39315.

[11] JACOB D，WAHAB T，EDVINSSON B，et al.Identification and subtyping of Francisella by pyrosequencing and signature matching of 16S rDNA fragments[J].Lett Appl Microbiol，2011，53（6）：592-595.

[12] 張磊，管越強(qiáng)，李艷琴，等.患病羅漢魚疑似病原菌分離鑒定與藥敏試驗[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（7）：3020-3022.

[13] 曹海鵬，何珊，劉麗玲，等.鱘源病原性嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌的鑒定及其生物學(xué)特性[J].微生物學(xué)通報，2011，38（9）：1377-1384.

[14] HORVAT RT，EL ATROUNI W，HAMMOUD K，et al.Ribosomal RNA sequence analysis of Brucella in-fection misidentified as Ochrobactrum anthropi infection[J].J Clin Microbiol，2011，49（3）：1165-1168.

[15] 王璐，梁利國，謝駿，等.嗜水氣單胞菌雙重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].水產(chǎn)科學(xué)，2013，32（4）：199-223.

[16] 辛志明，樊海平，吳斌，等.嗜水氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條的研制[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（7）：708-712.

[17] 白雪梅，李太元，楊興，等.應(yīng)用間接熒光抗體技術(shù)檢測林蛙嗜水氣單胞菌[J].水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（10）：613-615.

[18] PICOZZI C，BONACINA G，VIGENTINI I，et al.Genetic diversity in italian Lactobacillus sanfranciscensis strains assessed by Multilocus sequence typing and Pulsed-field gel electrophoresis analyses[J].Microbiology，2010，156：2035-2045.

[19] ZHOU H，LOTTNER S，GANTER M，et al.Identification of two new Dichelobacter nodosus strains in Germany[J].Veterinary Journa，2010，184（1）：115-117.

[20] WRY N，MONTEIL C，POURCHER A M，et al.Humanspecific fecal bacteria in wastewater treatment plant effluents[J].Water Rsearch，2010，44（6）：1873-1883.

[21] NOTOMI T.Loopmediated isothermal amplification[J].Nippon Rinsho，2007，65（5）：957-961.

[22] 曾桂芬，龍北國，姜容，等.LAMP和PCR法檢測痢疾志賀菌的特異性和靈敏性比較[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012，12（5）：547-549，592.

[23] 王蓉，王忠發(fā)，王志錚，等.實時熒光定量 PCR 快速檢測嗜水氣單胞菌方法的建立[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39（13）：3339-3341.

[24] GOSWARNI R，GHOSH D，SAHA D R，et al.Effect of acute and chronic arsenic exposure on growth，structure and virulence of Aeromonas hydrophila isolated from fish[J].Microbial Pathogenesis，2011，50（2）：63-69.

[25] 朱建萍，葉展翔，朱燁，等.嗜水氣單胞菌氣溶素毒力基因檢測研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2009，9（5）：810-811.

[26] 單小楓，郭偉生.嗜水氣單胞菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（5）：90-93.

[27] KOMMEDAL O，SIMMON K，KARACA D，et al.Dual priming oligonucleotides for broadrang amplification of the bacterial 16S rDNA gen directly from humanclinical specimens[J].J Clin Microbiol，2012，50（4）：1289-1294.

[28] MAHLEN S D，CLARRIDGE J E .Evaluation of a selectionstrategy before use of 16S rRNA gene sequencing for theidentification of clinically significant Gramnegative rods and coccobacilli[J].Am J Clin Pathol，2011，136（3）：381-388.