RP—HPLC法同時(shí)測定藏藥手掌參中3種抗AD活性成分的含量

姚晶　林鵬程

摘要 [目的]建立同時(shí)測定藏藥手掌參中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量測定方法。[方法]采用反相高效液相色譜法（RPHPLC），以ZORBAX SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；進(jìn)樣10 μl；乙腈-濃度0.5%的磷酸水梯度洗脫（0 min，7%；10 min，15%；20 min，20%；25 min，23%；30 min，40%；35 min，40%）；流速為0.7～1.0 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長222 nm。[結(jié)果]在35 min內(nèi)完成對3種抗AD活性成分的分析，各成分之間均達(dá)到基線分離。天麻素、dactylorhin A和militarine的線性范圍分別為：0.031 34～1.003 00 mg/ml（R=0.999 8）、0.038 06～1.218 00 mg/ml（R=0.999 6）、0.039 28～1.257 00 mg/ml（R=0.999 6）；平均加樣回收率（n=6）分別為98.88%、99.91%和100.48%。測定得青藏高原15個(gè)不同地區(qū)不同種屬的手參中3種抗AD活性成分的含量，以互助變異手參的含量最高。[結(jié)論]該方法建立的HPLC分析方法簡單準(zhǔn)確，能快速測定手參中有效成分的含量，青藏高原不同地區(qū)不同種屬手參中3種抗AD活性成分含量差異較大。

關(guān)鍵詞 RPHPLC；手掌參（Gymnadenia conopsea R.Br.）；天麻素；dactylorhin A；militarine；含量測定

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03865-03

Abstract [Objective] To determine the content of gastrodin， dactylorhin A and militarine in Tibetan herb Gymnadenia conopsea. [Method] The sample were separated on the column of ZORBAX SBC18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） which eluted with Acetonitrile（A） and water（B， 0.5% phosphoric acid）. The sample size was 10 μl. The initial condition was 7%A， chsnhrf to 15%A in 10 min， to 20%A in 10 min， to 23% in 5 min， to 40% in 5 min with detected wavelength at 222 nm， flow rate was from 0.7 to 1 ml/min， column temperature at 30 ℃. [Result] Three active constituents were baseisolated. The linear ranges of gastrodin， dactylorhin A and militarine were 0.031 34-1.003 mg/ml （R=0.999 8）， 0.038 06-1.218 mg/ml （R=0.999 6）， 0.039 28-1.257 mg/ml （R=0.999 6） respectively； the average recoveries（n=6） were 98.88%， 99.91% and 100.48% respectively. The content of three AntiAlzheimers active constituents in Tibetan herb Gymnadenia conopsea from fifteen different areas in Tibetan Plateau was determined. [Conclusion] The method is easy and precise which can be used for quantitative analysis of active constituents in Gymnadenia conopsea rapidly. The content of three active constituents changed at a great degree in different species and area.

Key words RPHPLC； Gymnadenia conopsea； Gastrodin； dactylorhin A； militarine； Content determination

手掌參（Gymnadenia conopsea R.Br.）是常用珍稀藏藥，味甘、性溫，具有增力生精、溫腎暖腎、大補(bǔ)元?dú)夂桶采裨鲋堑裙π?，具有很高的藥用價(jià)值[1]。天麻素、dactylorhin A和militarine是手掌參中抗AD活性成分的主要有效成分之一[2-4]。由于手掌參入藥品種繁多，各地藥材品質(zhì)有較大差異，同時(shí)藥材有效成分也受海拔、土壤、日照和降水量等環(huán)境因素的影響[5]。為了有效控制藥材的質(zhì)量，試驗(yàn)以天麻素、dactylorhin A和militarine為有效藥用指標(biāo)成分，建立青藏高原不同地區(qū)手掌參中抗AD活性成分的含量測定的高效液相色譜分析方法，以期為手掌參原藥材的質(zhì)量控制及制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 研究對象。手掌參，經(jīng)鑒定為Gymnadenia conopsea R.Br.。

1.1.2 主要儀器。FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)，購自北京永光明醫(yī)療儀器廠；AL204電子天平，購自Mettler Toledo；Agilent 1200高效液相色譜儀（配置自動(dòng)進(jìn)樣器，在線脫氣機(jī)，四元梯度泵，恒溫柱溫箱，DAD檢測器，Agilent 1200色譜工作站），購自Agilent公司；KQ250B型超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑。對照品天麻素。dactylorhin A和militarine，由課題組分離鑒定，純度>99%；色譜乙腈為高效液相色譜專用試劑，購自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠；磷酸為AR級，購自天津市紅巖試劑廠；水為娃哈哈飲用純凈水，市售。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。ZORBAX SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，進(jìn)樣10 μl，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為濃度0.5%磷酸水[5-7]；梯度洗脫程序[8-10]見表1，柱溫30 ℃[11]，檢測波長222 nm[12-13]。

1.2.2 對照品溶液的制備。分別精密稱取天麻素0.100 3 g，用無水甲醇溶于20 ml容量瓶中；取 0.040 6 g dactylorhin A，用無水甲醇溶于10 ml容量瓶中；再取0.041 9 g militarine，用無水甲醇溶于10 ml容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.3 供試溶液的制備。精密稱取手掌參樣品粉末1.000 g（過40目篩），置具塞錐形瓶中，精密加入濃度75%的乙醇20 ml，稱定重量，65 ℃超聲提取3 h，放冷后再稱定重量，用濃度75%乙醇補(bǔ)足重量，搖勻，過濾后即得供試品溶液。

1.2.4 方法學(xué)考察。（1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。取對照品溶液和供試品溶液適量，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。（2）線性關(guān)系的考察。分別取4 ml天麻素、6 ml dactylorhin A和6 ml militarine混合于20 ml容量瓶中，充分振蕩，再分別取10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 ml上述母液，分別定容于10 ml容量瓶中，得一系列不同濃度的對照品溶液。每次進(jìn)樣10 μl，以濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制3個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算3個(gè)組分的回歸方程。（3）精密度考察。取天麻素、dactylorhin A和militarine的混合對照品，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μl，計(jì)算峰面積的RSD。（4）穩(wěn)定性考察。精密吸取供試液溶液10 μl，分別在0、2、4、6、12和16 h重復(fù)進(jìn)樣6次，測定天麻素、dactylorhin A和militarine色譜峰面積的RSD。（5）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批手掌參樣品，均勻混合后精密稱取6份，每份1.000 g，按“1.2.3”項(xiàng)下制備，分別進(jìn)樣10 μl，記錄峰面積，并計(jì)算含量和RSD。（6）回收率試驗(yàn)。精密稱取已測知含量的手掌參樣品1.000 g共9份，分為3組，每組3份，分別添加低、中、高3種濃度的對照品，按“1.2.3”項(xiàng)下操作，測得平均回收率（n=9）和RSD。

1.2.5 樣品測定。按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備的青藏高原不同地區(qū)手掌參樣品，以“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為標(biāo)準(zhǔn)按外標(biāo)法計(jì)算青藏高原不同地區(qū)手掌參樣品中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察 （1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1～2表明，在此色譜條件下，對照品溶液和供試品溶液中3個(gè)有效成分的分離效果良好，各峰間無干擾。（2）線性關(guān)系的考察。由表2可知，在各自的有效范圍內(nèi)，3個(gè)有效成分的濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。（3）精密度考察。計(jì)算得天麻素峰面積的RSD為0.16%，dactylorhin A的峰面積的RSD為0.32%，militarine的峰面積的RSD為0.89%；表明精密度良好。（4）穩(wěn)定性考察。計(jì)算得天麻素、dactylorhin A和militarine面積RSD分別為1.02%、0.69%和1.39%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。（5）重復(fù)性試驗(yàn)。計(jì)算得天麻素的平均含量為2.198 4 mg/g，RSD為0.61%，dactylorhin A的平均含量為2.634 9

3.3 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)用無水甲醇-水、乙腈-濃度0.5%磷酸水溶液、乙腈-水溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示乙腈濃度0.5%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)樣品中天麻素、dactylorhin A和militarine分離效果及峰形均較好。

3.4 結(jié)論 筆者分別對15批青藏高原不同地區(qū)不同種屬手參中的天麻素、dactylorhin A和militarine進(jìn)行了含量測定。測定結(jié)果表明，各地區(qū)3種活性成分的含量差異較大，其中玉樹角盤蘭中dactylorhin A和militarine的含量較低，互助北山林場的變異手參各成分的含量均較高，具有較好的藥用價(jià)值。試驗(yàn)用反相高效液相色譜法同時(shí)測定藏藥手參中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量，操作簡便、快速、可靠，可為藏藥手參的質(zhì)量控制、資源評價(jià)等工作提供依據(jù)。

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