口腔材料細胞毒性評價方法的研究進展

石平 蔣均紅

隨著科學技術的進步，每年都有大量的口腔材料出現(xiàn)，而材料的生物相容性評價是確保材料能否用于人體的最重要因素，在細胞培養(yǎng)基礎上的細胞毒性試驗作為檢測生物材料毒性的手段目前已廣泛應用于口腔材料的生物相容性評價。細胞毒性試驗[1]是運用體外細胞培養(yǎng)技術檢測醫(yī)療器械和（或）其浸提液可能造成的細胞生長抑制、細胞變異、細胞溶解、細胞死亡等影響細胞正常功能和生物學行為的作用。該實驗是各種醫(yī)療器械臨床應用前安全性評價的必選項目和重要指標，其特點是能在短期內檢出供試品對細胞新陳代謝的影響，對毒性物質具有較大的敏感性，試驗重復性好，可以減少不必要的動物體內實驗。本文就細胞培養(yǎng)及兩種細胞毒性的評價方法綜述如下。

1 細胞培養(yǎng)的歷史沿革

細胞生物學是生命科學的理論基礎，也是現(xiàn)代生命科學的前沿科學，而細胞培養(yǎng)是其中的重要部分。細胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)[2]，目前細胞培養(yǎng)技術廣泛應用于生物醫(yī)學各個領域，是分子生物學和實驗室生物技術等的核心實驗室技術[3]。細胞培養(yǎng)始于20世紀初，1907年，Harrison利用懸滴法將分離自青蛙胚胎的神經(jīng)細胞種植在青蛙的淋巴液中，首次在體外模擬了細胞的生長活動，為后來開展體外細胞研究開辟了新途徑， Harrison也因此被譽為“細胞培養(yǎng)之父”[4]。1910年， Burrows在從Harrison實驗室學習了這種技術以后嘗試用雞血漿代替淋巴液培養(yǎng)細胞并獲成功。此后，Burrows與其外科醫(yī)生出身的同事Alexis Carrel進一步致力于哺乳動物組織的培養(yǎng)技術研究。1912年，Alexis Carrel[4]將外科手術嚴格的無菌技術引入細胞培養(yǎng)并發(fā)明了專門的細胞培瓶（Carr-el flask，卡氏培養(yǎng)瓶），顯著改良了Harrison所建立的培養(yǎng)技術并將其應用于成年組織細胞和腫瘤細胞的體外培養(yǎng)實踐中，由于此研究成果的重大貢獻，1912年，Alexis Carrel被授予諾貝爾醫(yī)學與生理學獎，此后Alexis Carrel在體外成功培養(yǎng)了分離自雞胚心臟的心肌細胞，并將其一直培養(yǎng)到了1946年，證明了體外細胞不但可以存活而且能傳代增殖。1949年，Alan Parks發(fā)明了-196℃超低溫凍存細胞的技術，成為細胞培養(yǎng)歷史上又一次重大的技術進步。此后，抗生素和胰蛋白酶的出現(xiàn)，也極大地促進了細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展。1952年，GO Gey[4]成功地培養(yǎng)了人類腫瘤組織并建立至今仍使用的HeLa細胞系，使細胞培養(yǎng)發(fā)展到人類組織培養(yǎng)階段。20世紀80年代，以眾多細胞系的建立為特點?，F(xiàn)在細胞培養(yǎng)基本上滲透到到生命科學的各個領域，隨著培養(yǎng)條件的改善，該技術也越來越容易掌握。

2 根據(jù)材料和細胞接觸方式的細胞毒性評價方法

依據(jù)接觸方式，目前常用的評價口腔醫(yī)療器械細胞毒性試驗方法有以下三種[5]：瓊脂擴散試驗、濾膜擴散實驗、直接接觸實驗。①瓊脂擴散試驗（間接接觸試驗）：適用于固體（包括粉末）和液體等試驗材料的檢測，通過瓊脂糖擴散后來評價材料的非特異性細胞毒性；②濾膜擴散實驗（間接接觸試驗）：適用于固體（包括粉末）和液體等試驗材料的檢測，通過乙酸纖維素濾膜擴散后評價材料的非特異性細胞毒性；③直接接觸實驗（包括浸提液試驗）：該試驗適用于評價固體材料和材料浸提液或液體材料的細胞毒性。

在應用直接接觸試驗時，體外培養(yǎng)的細胞，失去了身體神經(jīng)體液的調節(jié)和細胞間相互作用的影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中，而且其生長受營養(yǎng)條件、生長空間等因素的限制，所以，Hensten 等[6]認為，直接接觸法所得的結果不能反映材料在口腔內實際的生物相容性，缺乏準確性。在間接接觸試驗中，瓊脂擴散試驗和濾膜擴散實驗利用可溶性抗原與相應抗體特異性結合，從而來檢測標本中各種免疫球蛋白和血清中各種補體成分的含量，敏感性很高。Murray 等[7]研究表明在間接接觸試驗中，瓊脂或者濾膜作為屏障用于模擬口腔黏膜，能較為真實地反映口腔的環(huán)境，但瓊脂類材料和牙本質的滲透性還是有很大的區(qū)別[8]，故而間接接觸試驗不能有效地反映牙本質情況，目前的標準體外細胞毒性試驗存在一些不足之處，主要原因是試驗細胞與試驗材料之間沒有牙本質屏障[9]。近年來，國內陳志軍等[10]利用人工羥基磷灰石陶瓷片模擬牙本質，從而確保牙本質通透性的可控性，為口腔材料體外細胞毒性試驗提供了一個高效可靠的評價方法。

3 生物學終點評價細胞毒性的評價形式

生物學終點評價形式包括以下五種：

3.1細胞形態(tài)學評價：主要是觀察細胞的形態(tài)變化，該方法是最早用于檢測細胞損傷的方法，通過在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的改變，可以判斷細胞是否有污染、是否健康以及增殖情況。在顯微鏡下，通過觀察裂解細胞所占的比例來評估細胞毒性級別，Sujata等[11]研究得出細胞形態(tài)學評價方法與MTT法等定量細胞毒性法的Perason相關系數(shù)為0.9，表明兩者具有良好的相關性。目前，該方法仍廣泛用于生物材料細胞毒性的評價。

3.2細胞膜性效應評價：主要是從細胞膜的通透性改變方面來鑒別存活細胞與死亡細胞，包括以下兩種試驗方法。

3.2.1中性紅攝取試驗（NRU）：1986年，Borenfreund等[12]建立中性紅攝取試驗，并對多種材料細胞毒性進行評價，表明該試驗是快速評價細胞毒性的方法。國際標準ISO已收錄該檢測方法，經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）也于2010年將該方法列為細胞毒性試驗預測急性經(jīng)口毒性試驗起始劑量的指導性文件[13]。

3.2.2乳酸脫氫酶釋放法（LDH 釋放法）：乳酸脫氫酶（LDH）是活細胞胞漿內酶之一，正常情況下，不能透過細胞膜。當細胞受到損傷時，細胞膜通透性改變，LDH可釋放至細胞外，所以培養(yǎng)基中該酶活性與被裂解的細胞數(shù)量成正比，采用全自動生化分析儀直接檢測細胞培養(yǎng)板上清液中LDH，可以反映細胞損傷程度。此方法操作簡便，靈敏度高，用LDH釋放法檢測腫瘤患者CIK細胞（細胞因子誘導的殺傷細胞）活力，有助于CIK療法適應患者的選擇及個體療效觀察[14]。

3.3細胞代謝活性評價：該方法是通過檢測細胞生物代謝或生物合成功能的改變來了解細胞損傷作用，當前，以活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶作為生物學終點的評價方法可以靈敏地反映材料對細胞的損害程度[15]。主要包括MTT實驗和XTT實驗。

3.3.1 MTT試驗：MTT試驗以活細胞代謝物還原劑3-（4，5）-dimethylthia-hiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑藍為基礎，通過MTT噻唑藍作用于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，生成非水溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，且MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。目前該試驗作為材料細胞毒性評價方法，實驗步驟規(guī)范標準化，結果準確，簡便快速[16-17]，但是在試驗過程的結晶產物，需要用二甲基亞礬（DMSO）溶解后才能測定光吸收值，若是溶解不充分，會影響測定結果，從而使得MTT靈敏度略差，因此，楊曉冉等[18]建議MTT法和中性紅攝取試驗（NRU）聯(lián)合使用。

3.3.2 XTT試驗：XTT試驗在MTT的基礎上，省去溶解還原產物結晶的步驟，1988年，Scudiero等[19]首次采用該方法檢測細胞增殖。XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物，可被活細胞線粒體脫氫酶還原成水溶性的棕色甲肷產物，當XTT與電子偶合劑共同使用時，甲肷的生成量與細胞的增殖程度呈正相關。該試驗方法較MTT 法具有顯著優(yōu)點，已被納入國際標準ISO10993-5：2009中，但XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用，成本較高。

3.4細胞增殖率評價：主要是觀察材料或材料浸提液與細胞接觸后細胞生長速度和增殖的變化，主要有克隆形成試驗。最早由Tuchiya提出，用克隆形成率（實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)）來評價材料的細胞毒性。Tuchiya等[20]研究表明，克隆形成試驗較分子濾過法、瓊脂覆蓋法、中性紅攝取法更為敏感，目前該方法已收錄在國際標準ISO 10993-5：2009中。

3.5 DNA合成率檢測評價：通過測定有絲分裂的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力，主要有5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）滲入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法。敏感性很高，但重復性略差[21]。

綜上所述，評價材料的體細胞毒性的試驗方法較多，而由于不同材料接觸方式及毒理不一，各試驗方法之間又存在很大的敏感差異。因此，Weyermann等[22]提倡在選擇試驗方法時，必須根據(jù)“最接近應用狀況”的原則，合理地選擇樣品與細胞的接觸方式和檢測生物學終點的評價方法。

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[收稿日期]2014-05-26 [修回日期]2014-06-19

編輯/李陽利