LC-MS/MS法測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量

黃翠云 張鳳 柳珂 陳萬生 楊軍

摘 要 目的：建立測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇含量的方法。方法：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)，以文多靈為內(nèi)標(biāo)，測定腫瘤患者給予紫杉醇后惡性腹水中紫杉醇的含量，色譜柱為Zorbax SB-C18，流動相為水溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L醋酸銨）-乙腈溶液（40 ∶ 60，V/V），流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL，離子源為電噴霧離子源，檢測模式為多重反應(yīng)離子監(jiān)測正離子模式，干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為10 L/min，毛細管電壓為4 000 V，紫杉醇和內(nèi)標(biāo)在正離子模式下質(zhì)荷比（m/z）分別為876.5→308.0、457.3→188.1，碎片電壓分別為250、150 V，碰撞電壓分別為30、20 eV。結(jié)果：紫杉醇檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為25～2 500 ng/mL（r2=0.996 5，n=7）;定量下限為25 ng/mL;日內(nèi)、日間精密度試驗的RSD為0.61%～3.62%（n=5、3）;準(zhǔn)確度為95.34%～98.76%（n=5、3）;提取回收率的RSD為3.19%～3.72%（n=3）;基質(zhì)效應(yīng)的CV為1.52%～2.93%（n=3）;穩(wěn)定性試驗的RE均小于3%（n=3）。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確，可用于測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量。

關(guān)鍵詞 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;腫瘤患者;腹水;紫杉醇;含量測定

中圖分類號 R969 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）01-0086-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.15

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for content determination of paclitaxel in malignant ascites of tumor patients. METHODS： LC-MS/MS method was adopted. Using vindoline as internal standard， the content of paclitaxel in ascites of tumor patients was determined. The separation was performed on Zorbax SB-C18 column with mobile phase consisted of aqueous solution （containing 0.1% formic acid and 10 mmol/L ammonium acetate）-acetonitrile （40 ∶ 60， V/V） at the flow rate of 0.25 mL/min. the column temperature was 30 ℃， and sample size was 5 μL. The ion source was electrospray ion source， and the detection mode was multiple ion monitoring positive ion mode. MS parameters were set as following as dry gas temperature 350 ℃，dry gas flow rate 10 L/min，capillary voltage 4 000 V. Quantitative determination was operated in the multiple reaction monitoring （MRM） mode，with the ion transitions m/z 876.5→308.0 for paclitaxel and m/z 457.3→188.1 for the internal standard. The fragment voltage/collision energy for paclitaxel and the internal standard were 250 V/30 eV， and 150 V/20 eV，respectively. RESULTS： The linear range of paclitaxel were 25-2 500 ng/mL （r2=0.996 5， n=7）. The lowest limit of quantitation was 25 ng/mL. RSDs of inter-day and intra-day precision tests were 0.61%-3.62%（n=5， 3）. Accuracies were 95.34%-98.76%（n=5， 3）. RSDs of extraction recovery were 3.19%-3.72%（n=3）. CV of matrix effect were 1.52%-2.93%（n=3）. RE of stability tests were lower than 3% （n=3）. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate and suitable for the content determination of paclitaxel in malignant ascites of tumor patients.

KEYWORDS? ?LC-MS/MS; Tumor patient; Malignant ascites; Paclitaxel; Content determination

惡性腫瘤已經(jīng)成為全球較大的公共衛(wèi)生問題之一[1]。惡性腹水是由于惡性腫瘤病變引起腹腔臟壁層腹膜發(fā)生彌漫性病變而導(dǎo)致腹腔內(nèi)液體異常增多的現(xiàn)象，是惡性腫瘤晚期常見的并發(fā)癥，在40%～60%的惡性腹水中能找到脫落的惡性腫瘤細胞[2]。紫杉醇是具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物，在過去的幾十年里，紫杉醇廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的治療，以紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療是上述惡性腫瘤晚期腹水的主要治療方案[3-4]。已有研究表明，全身化療聯(lián)合腹腔灌注化療方案對于全身多器官轉(zhuǎn)移的晚期胃癌患者，尤其是腹膜轉(zhuǎn)移胃癌患者，能夠使抗癌藥物在腹腔內(nèi)維持較高的血藥濃度，從而抑制腫瘤細胞生長[5]。但目前尚未有相關(guān)研究開展紫杉醇惡性腹水濃度與療效之間的關(guān)系研究，而僅僅監(jiān)測紫杉醇在血漿中的濃度不能準(zhǔn)確反映其在惡性腹水中的濃度，因此，需建立穩(wěn)定、可靠的檢測方法，監(jiān)測紫杉醇在惡性腹水中的藥物濃度，為未來開展其濃度-療效相關(guān)性研究提供檢測技術(shù)。

目前已有多種分析方法對紫杉醇進行測定，例如反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定大鼠血漿中紫杉醇的濃度[6]、RP-HPLC法或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）測定制劑中紫杉醇的含量[7-8]。但關(guān)于惡性腹水中紫杉醇含量的檢測方法目前研究較少。LC-MS/MS法是一種靈敏度高、特異性強的紫杉醇含量測定方法。因此，本課題組在前期研究[9]的基礎(chǔ)上，采用LC-MS/MS法，以文多靈為內(nèi)標(biāo)，建立了測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇含量的方法，以期為臨床監(jiān)測相關(guān)患者惡性腹水中紫杉醇的有效濃度提供檢測技術(shù)。紫杉醇和文多靈化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC-G6410A型三重四級桿MS/MS儀，包括G1311A型四元泵、G1322A型真空脫氣機、G1329A型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、MassHunter軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理工作站B.01.03（美國Agilent公司）;BSA124S-CW型天平、CPA225D型天平（德國Sartorius公司）;Mini spin型離心機（德國Eppendorf公司）;Labnet VX-200型定時可調(diào)速渦旋混合器（美國Labnet公司）;SK7200H型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;UNIVERSAL32R型臺式冷凍離心機（德國Hettich公司）。

1.2 藥品與試劑

紫杉醇對照品（批號：M1201AS，純度：98%）、文多靈對照品（批號：J1011AS，純度：98%）均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;甲醇（批號：10951907818，質(zhì)譜級）、乙腈（批號：JA075930，質(zhì)譜級）均購自德國默克公司;甲酸（批號：17033D，分析純）、乙酸銨（批號：H1709024，色譜純）均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司;水為屈臣氏純凈水。

1.3 樣品

空白腹水及含藥腹水均由上海長征醫(yī)院腫瘤科提供，分別為2例腫瘤患者未給藥和腹腔注射紫杉醇后6、8、12、24 h的腹水樣品，給藥劑量為20 mg/m2，所有患者都簽署知情同意書。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 貯備液的制備 分別精密稱取紫杉醇對照品2.01 mg、文多靈對照品2.00 mg，分別置于2 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的紫杉醇貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液，搖勻即得，于-20 ℃冰箱保存，備用。

2.1.2 工作液的制備 精密量取紫杉醇貯備液適量，以10%甲醇溶液稀釋，制備成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、25.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以及質(zhì)量濃度分別為0.625、2.5、12.5 μg/mL的質(zhì)控工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液與質(zhì)控樣品溶液的制備 取“2.1.2”項下制備的7個水平的標(biāo)準(zhǔn)工作液和3個水平的質(zhì)控工作液，分別用生理鹽水稀釋10倍，即得紫杉醇質(zhì)量濃度分別為25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250? ? ng/mL的質(zhì)控樣品溶液。

2.2 腹水樣品的處理

取腹水樣品100 μL，加1 900 μL生理鹽水稀釋，渦旋30 s混勻;取稀釋樣品50 μL，置于1.5 mL的離心管中，加入含100 ng/mL內(nèi)標(biāo)的 0.1%甲酸甲醇溶液200? ? μL，渦旋混合3 min，19 751.6 ×g離心10 min，取上清液100 μL轉(zhuǎn)移至自動進樣小瓶，進樣檢測。

2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）;流動相：水溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L 醋酸銨）-乙腈溶液（40 ∶ 60，V/V）;流速：0.25 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：5 μL。

采用電噴霧離子源（ESI），多重反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）正離子模式，毛細管電壓：4 000 V，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速：10 L/min，碰撞氣壓力：40 psi，流速：10 L/min，紫杉醇和文多靈的定量分析質(zhì)荷比（m/z）分別為876.5→308.0、457.3→188.1，碎片電壓分別為250、150 V，碰撞電壓分別為30、20 eV。

2.4 專屬性考察

取空白腹水、空白腹水+紫杉醇對照品、含藥腹水（給藥后6 h），按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄圖譜。結(jié)果顯示，紫杉醇峰形良好，空白腹水中雜質(zhì)不干擾紫杉醇和內(nèi)標(biāo)文多靈的檢測，專屬性符合相關(guān)要求。LC-MS/MS的總離子流圖見圖2。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和定量下限

取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度分別為25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，每一個濃度平行做5個樣品進行分析。以紫杉醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），紫杉醇與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo) （y），進行加權(quán)線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/x2。得紫杉醇的回歸方程為y=0.001 8x-0.001 0（r2=0.996 5，n=7），線性質(zhì)量濃度范圍為25～2 500 ng/mL，定量下限為25 ng/mL。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度試驗

取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250? ? ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，每一個濃度平行做5個樣品進行分析，連續(xù)測定3 d。根據(jù)當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)控樣品溶液的實測質(zhì)量濃度，考察日內(nèi)、日間精密度的RSD，并以實測質(zhì)量濃度/標(biāo)示質(zhì)量濃度×100%計算準(zhǔn)確度。精密度與準(zhǔn)確度試驗結(jié)果見表1。

2.7 提取回收率試驗

分別取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度為62.5、250、1 250 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，各3份，按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積A;另取空白腹水，按“2.2”項下方法處理后，加入紫杉醇對照品溶液，制備成上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品溶液，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積B，以A/B×100%計算提取回收率。提取回收率試驗結(jié)果見表2。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)考察

分別取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，各3份，按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積A;另取“2.1.2”項下質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質(zhì)控工作液，各3份，按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積C，以A/C×100%計算基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見表3。

2.9 穩(wěn)定性試驗

分別取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，分別考察下列條件下的穩(wěn)定性，每一個濃度平行做3個樣品進行分析?？疾鞐l件：（1）室溫條件下放置6 h，然后按“2.2”項下方法處理，再按照“2.3”項下條件進樣測定;（2）自動進樣室中放置24 h，再處理后進樣測定;（3）-20 ℃下冷凍，室溫融解，反復(fù)凍融3次，再處理后進樣測定;（4）-20 ℃下放置30 d，再處理后進樣測定。結(jié)果顯示，所有質(zhì)控樣品均未出現(xiàn)降解、變質(zhì)等變化，穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。

2.10 腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量測定

取2例腫瘤患者腹腔注射紫杉醇后0、6、8、12、24 h的腹水樣品，紫杉醇的給藥劑量為20 mg/m2，將腹水樣品按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，代入回歸方程計算惡性腹水中紫杉醇的含量。2例腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的藥-時曲線圖見圖3。

3 討論

3.1 LC-MS/MS條件的確定

筆者參考文獻[10-12]，在預(yù)實驗中分別考察了色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm，3.5? ? ? ?μm）、Agilent poroshell SB C18（75 mm×2.1 mm，2.7 μm）、Waters XBridge? BEH C18（50 mm×2.1mm，2.5 μm）時，對紫杉醇含量測定的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18時，紫杉醇及內(nèi)標(biāo)的峰形最佳;流動相為乙腈/甲醇-甲酸水溶液、乙腈/甲醇-醋酸銨水溶液、乙腈/甲醇-甲酸與醋酸銨混合水溶液時，對紫杉醇含量測定的影響，結(jié)果顯示，紫杉醇在水溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L醋酸銨）-乙腈溶液（40 ∶ 60，V/V）等度洗脫的條件下響應(yīng)、峰形均較好;柱溫為20、25、30 ℃時，對紫杉醇含量測定的影響，結(jié)果顯示，柱溫越高紫杉醇的出峰時間越早，且對峰形與峰面積無明顯影響，故為了節(jié)省分析時間選擇了柱溫為30 ℃;流速為0.25、0.3 mL/min時，對紫杉醇含量測定的影響，結(jié)果顯示，紫杉醇峰面積在0.3 mL/min流速下存在峰面積下降的情況，故選擇了流速為0.25 mL/min。

3.2 樣品的前處理

筆者在腹水處理過程中參考并借鑒了相關(guān)文獻中紫杉醇在血漿樣本中的處理方法[13-15]，結(jié)果顯示，相對于液-液萃取法，本實驗采用的蛋白沉淀法更加簡單快捷。其中，相比于乙腈，甲醇的沉淀效果更好，不易導(dǎo)致儀器系統(tǒng)壓力過高，并且在甲醇中加入少許甲酸可獲得較高的提取回收率，最終確定沉淀劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液。依據(jù)相關(guān)文獻[16-18]，選擇了多種沉淀劑比例V腹水 ∶ V沉淀劑（1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)二者比例超過1 ∶ 4后，提取回收率均無明顯變化，故最終選擇沉淀劑與含0.1%甲酸的甲醇體積比為1 ∶ 4的方案。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

在內(nèi)標(biāo)選用時，筆者參考相關(guān)文獻[19]，選用了與紫杉醇物理化學(xué)性質(zhì)相似的，且響應(yīng)好、穩(wěn)定的文多靈作為內(nèi)標(biāo)。

4 結(jié)語

綜上所述，本實驗通過對腹水樣品處理及色譜、質(zhì)譜條件進行了良好的優(yōu)化后，基于LC-MS/MS法建立了惡性腹水中紫杉醇的定量檢測方法。該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，線性、穩(wěn)定性、提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)等符合2015年版《中國藥典》生物樣本檢測方法的要求，為未來腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的代謝研究、量效關(guān)系考察提供了研究基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-09-10 修回日期：2019-11-13）

（編輯：鄒麗娟）