北京市售生鮮豬肉和牛肉中有害細(xì)菌的鑒定及耐藥性分析

秦宇軒 李晶 朱寶利 律娜 辛建橋 金祿懿

摘?要：采用選擇性培養(yǎng)基初步篩選，結(jié)合16S rRNA同源性分析的方法，對北京市農(nóng)貿(mào)市場及超市中所銷售的生鮮豬、牛肉中含有的有害細(xì)菌的分布情況進(jìn)行考察。對分離得到的細(xì)菌針對7種常見抗生素進(jìn)行耐藥表型檢測。同時，利用特異性PCR擴(kuò)增法檢測了2個常見紅霉素耐藥基因和7個常見四環(huán)素耐藥基因在分離細(xì)菌中的分布情況。結(jié)果表明：市場中購買的生鮮肉中分離得到的細(xì)菌耐藥情況較之超市中的更為嚴(yán)重；豬肉和牛肉中分離的細(xì)菌耐藥情況均十分嚴(yán)重；分離得到的不同細(xì)菌中包含某些條件致病菌的Escherichia/Shigella以及Aeromonas屬細(xì)菌耐藥情況更加嚴(yán)重。同時，研究還發(fā)現(xiàn)在北京市售鮮肉中分離得到的細(xì)菌中，絕大多數(shù)細(xì)菌對不止1種抗生素表現(xiàn)出非敏感（耐藥及中介），且一些菌株攜帶多種不同的耐藥基因。因此，市售生鮮肉中分離得到的細(xì)菌耐藥情況較為嚴(yán)重以及普遍，應(yīng)得到監(jiān)管部門以及普通消費(fèi)者的足夠重視。

關(guān)鍵詞：生鮮肉；致病菌；鑒定；耐藥表型；耐藥基因

Identification and Drug Resistance Analysis of Pathogens in Retail Pork and Beef from Beijing

QIN Yu-xuan1, LI Jing2, ZHU Bao-li2, Lü Na2,*, XIN Jian-qiao3, JIN Lu-yi4,

(1. College of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550025, China;

2. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;

3. Beijing No.80 High School, Beijing 100020, China;

4. School of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048, China)

Abstract: Distribution of pathogens in retail pork and beef from Beijing supermarkets and markets were investigated by selective culture and 16S rRNA sequencing. The antibiotic resistant phenotypes of all the isolates were detected, including 7 common antibiotics. Meanwhile, two common erythromycin resistance genes and seven common tetracycline genes were detected among all the isolates. The results showed that the drug resistance of bacteria isolated from meat samples collected from markets was more serious; both the isolates from pork and beef showed serious drug resistance; among all the isolated bacteria, Escherichia/Shigella and Aeromonas genus, which contained some opportunistic pathogen species, showed the most serious drug resistance. Meanwhile, we also found that the majority of the isolates were non-susceptible (resistant and intermediate) to several kinds of antibiotic, and some of the isolates carried more than one antibiotic resistance genes (ARGs). The above evidence showed that drug resistance was common and serious among bacteria isolated from commercial meats. Both regulators and consumers should pay more attention to it.

Key words: meats; pathogen; identification; antibiotic resistance phenotype; antibiotic resistance gene

中圖分類號：TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）02-0016-06

近年來隨著我國國民生活水平的日益提高，廣大消費(fèi)者對生鮮肉類，尤其是生鮮豬、牛肉的需求也隨之增加。目前，我國已經(jīng)成為世界養(yǎng)豬大國，生豬出欄量、豬肉產(chǎn)量均位居世界第一[1]，牛肉的消費(fèi)量也十分巨大。與此同時，由于食用豬、牛肉及其相關(guān)制品所導(dǎo)致的食物中毒以及傳染病的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。食物中毒及傳染病的發(fā)生主要是由生鮮豬、牛肉中所含有害細(xì)菌導(dǎo)致的，而主要的有害細(xì)菌包括大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）等[2-6]。上述細(xì)菌進(jìn)入人體后所產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)會對人們身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響，甚至危及生命。

抗生素是20世紀(jì)人類最偉大的發(fā)明之一，它在治療感染性疾病方面有著不可替代的作用。但近半個世紀(jì)以來抗生素的使用范圍不斷擴(kuò)大，已經(jīng)不再局限于醫(yī)療衛(wèi)生和獸醫(yī)方面，在養(yǎng)殖業(yè)和食品加工業(yè)的用量也有逐年上升的趨勢，尤其在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)中最為嚴(yán)重，我國每年抗生素原料生產(chǎn)量約為21萬噸，其中9.7萬噸（占年總產(chǎn)量46.1%）用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[7]。抗生素的大量使用所帶來的選擇性壓力必然加速細(xì)菌對某種抗生素，甚至多種抗生素的耐藥進(jìn)程。耐藥細(xì)菌尤其是超級細(xì)菌（如攜帶有NDM-1基因的細(xì)菌）已經(jīng)成為人們在應(yīng)對細(xì)菌感染疾病時的巨大挑戰(zhàn)[8]。如果攜帶有耐藥基因（antibiotic resistance genes，ARGs）的，對抗生素非敏感（包括耐藥菌株和中介菌株）的細(xì)菌進(jìn)入人體，致病菌可能導(dǎo)致某種或幾種甚至是所有常用抗生素在治療時失去療效，普通的環(huán)境細(xì)菌還可以將所攜帶的耐藥基因傳遞給人體內(nèi)其他的致病菌或者條件致病菌，使它們均產(chǎn)生耐藥性，對人類健康造成極大威脅[9]。細(xì)菌耐藥問題對人們身體健康所帶來的危害日趨嚴(yán)重。動物腸道中的有害菌以及耐藥細(xì)菌可能經(jīng)屠宰加工過程進(jìn)入到鮮肉及其制品當(dāng)中，同時很有可能借助此環(huán)節(jié)傳播至人類體內(nèi)，對人們身體健康甚至是生命安全帶來威脅。

本實(shí)驗(yàn)旨在檢測北京市售生鮮豬、牛肉中常見有害微生物，同時對其耐藥表型以及所攜帶耐藥基因的情況進(jìn)行檢測，為市售生鮮豬、牛肉的安全評價體系提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

處于產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)的生鮮豬、牛肉樣品共8份 市售。

藥敏檢測紙片 英國Oxoid公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；2×PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液（含有Mg2+） 寶生物工程（大連）有限公司；實(shí)驗(yàn)所需引物均由上海生工生物工程有限公司北京合成部合成。

1.2 儀器與設(shè)備

微量移液器 法國Gilson公司；Z216 MK型離心機(jī)型 德國Hermle公司；HPX-9272 MBX型恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅公司；ND1000型微量核酸定量儀 美國NanoDrop公司；2720型PCR儀 美國Applied Biosystems公司；Powerpac基礎(chǔ)型電泳儀 美國Bio-Rad公司；AlphaImager EP型凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司等。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離及菌落計(jì)數(shù)

編號生鮮豬肉或肉餡樣品為P1、P2、P3、P4；生鮮牛肉樣品為B1、B2、B3、B4。把從市場或超市中收集到的每一份生鮮肉樣本取一部分放入沸水中處理3?min進(jìn)行表面滅菌，用無菌刀去掉鮮肉的表層，取中間的紅色鮮肉部分切成碎末，稱取12.5?g切碎的鮮肉放入50?mL離心管中，標(biāo)記為“肉內(nèi)”；樣本剩余部分用無菌刀取表面鮮肉部分并切成碎末，稱取12.5?g切碎的鮮肉放入50?mL離心管中，標(biāo)記為“肉外”；稱取從同一地點(diǎn)購買的肉餡12.5?g放入50?mL離心管中，標(biāo)記為“肉餡”，以上操作均在超凈工作臺中進(jìn)行。

向裝有上述鮮肉樣品的離心管中加入50?mL生理鹽水致，至于振蕩器上緩慢振蕩，置于試管架上靜置1?h，待樣品自然沉淀后，取100?μL或50?μL上清液分別涂布于普通LB固體培養(yǎng)基、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌選擇性固體培養(yǎng)基上，37?℃培養(yǎng)過夜，用于樣品的菌落計(jì)數(shù)以及有害細(xì)菌的初步分離與篩選，實(shí)驗(yàn)方法參照GB 4789.2—94《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測定》進(jìn)行[10]。根據(jù)選擇培養(yǎng)結(jié)果，每種鮮肉樣本上的3種選擇性培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑選3～5個單菌落，編號EP(B)1-1、EP(B)1-2……EP(B)1-5；SMP(B)1-1、SMP(B)1-2……SMP(B)1-5；SAP(B)1-1、SAP(B)1-2……SAP(B)1-5。其中“E、SM、SA”分別代表大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基上篩選出來的菌株；“P、B”分別代表豬肉及其肉餡和牛肉及其肉餡中篩選出來的菌株。其余樣本均以此命名方法類推，接種于4?mL LB液體培養(yǎng)基中37?℃富集培養(yǎng)過夜備用。富集培養(yǎng)出的菌株用于菌種的保藏、基因組DNA的提取和菌種的耐藥表型實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 菌種基因組DNA的提取

依據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的使用說明對所有富集培養(yǎng)后的菌種進(jìn)行基因組DNA的提取，提取結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色后通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測，并用微量核酸定量儀進(jìn)行濃度測定。

1.3.3 16S rRNA測序

挑選出來的所有111株菌種用27F:（5-AGAGTT

GATCMTGGCTCAG-3）和1492R:（5-TACGG

YTACCTTGTTACGACTT-3）[11]引物進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（30μL）：50～100ng模板DNA，上下游引物各0.1μmoL，2×PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液（含有Mg2+）15μL，補(bǔ)足雙蒸水至30μL。反應(yīng)條件為94?℃、5?min；94?℃、30?s，55?℃、30?s，72?℃、90?s，35個循環(huán)；72?℃、10?min[11]。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)EB染色后檢測是否擴(kuò)增成功，結(jié)果呈陽性的樣本送華大基因組中心有限公司，用相同的引物進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)拼接后在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，如果所測序列與已知序列一致性大于97%就認(rèn)為所測序列為該種細(xì)菌[12]。

1.3.4 菌株耐藥表型分析

分離得到的111株細(xì)菌經(jīng)富集培養(yǎng)后，吸取100?μL菌液涂布于固體LB培養(yǎng)基上，取7種不同類型的藥敏檢測紙片：土霉素（四環(huán)素類，30?μg）、萬古霉素（糖肽類，30?μg）、頭孢氨芐（β-內(nèi)酰胺類，30?μg）、慶大霉素（氨基糖苷類，10?μg）、四環(huán)素（四環(huán)素類，30?μg）、鏈霉素（氨基糖苷類，10?μg）以及紅霉素（大環(huán)內(nèi)脂類，5?μg），放置于涂布完成的平板上，37?℃培養(yǎng)過夜，測量平板上抑菌圈的直徑，結(jié)果參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）關(guān)于紙片擴(kuò)散法的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷[13]。

1.3.5 菌株耐藥基因擴(kuò)增

表 1 耐藥基因擴(kuò)增引物及退火溫度

Table 1 Primers and PCR conditions for selected antibiotic resistance genes

引物 引物序列（5→3） 退火溫度/℃ 目的片段長度/bp

erm A F:AAGCGGTAAACCCCTCTGA 55 190[14]

R:TTCGCAAATCCCTTCTCAAC

erm B F:GAAAAGRTACTCAACCAAATA 52 642[15]

R:AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC

tet M F:GTTAAATAGTGTTCTTGGAG 55 576[16]

R:CTAAGATATGGCTCTAACAA

tet K F:TTAGGTGAAGGGTTAGGTCC 55 697[16]

R:GCAAACTCATTCCAGAAGCA

tet L F:CATTTGGTCTTATTGGATCG 50 456[16]

R:ATTACACTTCCGATTTCGG

tet S F:ATCAAGATATTAAGGAC 56 573[17]

R:TTCTCTATGTGGTAATC

tet O F:AACTTAGGCATTCTGGCTCAC 52 515[17]

R:TCCCACTGTTCCATATCGTCA

tet Q F:AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG 56 169[17]

R: CGGAGTGTCAATGATATTGCA

tet W F:GAGAGCCTGCTATATGCCAGC 64 168[18]

R:GGGCGTATCCACAATGTTAAC

因紅霉素和四環(huán)素是飼料行業(yè)使用非常廣泛的2種抗生素。現(xiàn)有報道顯示，人體腸道耐藥基因的種類及豐度與臨床用抗生素種類關(guān)系不明顯，反而與獸用抗生素的使用存在著一定的關(guān)聯(lián)性[12]。故本研究對市售生鮮豬、牛肉中分離得到的細(xì)菌進(jìn)行了常見紅霉素以及四環(huán)素耐藥基因的檢測，包括2個紅霉素抗性基因（erm A、erm B）以及7個四環(huán)素抗性基因（tet M、tet L、tet O、tet Q、tet S、tet W、tet K）[14-18]，上述不同基因的引物序列以見表1。PCR反應(yīng)體系（30?μL）：上下游引物各0.1?μmoL，2×PCR?mix（dNTPs、Mg2+、PCR緩沖液以及Taq?DNA聚合酶）15μL，50～100?μg?DNA?模板，補(bǔ)足雙蒸水到20?μL。反應(yīng)條件為94?℃預(yù)變性5?min；94?℃變性30?s，72?℃?延伸60?s，退火30?s（不同基因退火溫度見表1），共40個循環(huán)；72?℃?延伸10?min[13,16]。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)EB染色后通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。為了確認(rèn)PCR產(chǎn)物為耐藥基因，陽性結(jié)果送北京華大基因公司用相同的引物進(jìn)行測序確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離計(jì)數(shù)與DNA提取

如表2所示，不同鮮肉樣品不同部位的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：所有樣品內(nèi)部的細(xì)菌數(shù)量均少于10?CFU/g；樣品表面即肉外的細(xì)菌數(shù)量從40?CFU/g到滿板，不同樣品肉外的細(xì)菌的數(shù)量差別較大；肉餡樣品中的細(xì)菌含量最少也達(dá)到了200?CFU/g，多數(shù)肉餡樣品中的細(xì)菌數(shù)量多至無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。同時研究還發(fā)現(xiàn)來自超市中生鮮肉（B3、P3）所帶的細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)小于市場上收集的生鮮肉（B4、P4）所攜帶的細(xì)菌數(shù)，如肉內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目超市中的鮮肉為0～1.04?CFU/g，而市場樣品為6.4（P4）和9.6（B4）。

用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基對8份市售生鮮肉樣品中的細(xì)菌進(jìn)行初步分離、培養(yǎng)，按照目的細(xì)菌的挑選原則，隨機(jī)挑選出大腸桿菌，金黃色葡萄球菌株，沙門氏菌各40株，合計(jì)120株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，共得到111份擴(kuò)增培養(yǎng)后的菌液。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，111株細(xì)菌均成功提取了基因組DNA。

表 2 不同樣品菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

Table 2 Results of colony counting for different samples

樣品編號 部位 數(shù)量/(CFU/g) 樣品編號 部位 數(shù)量/(CFU/g)

B1 內(nèi) 0.08 P1 內(nèi) 1.04

外 40 外 68

餡 — 餡 —

B2 內(nèi) 0 P2 內(nèi) 0.4

外 16 外 160

餡 — 餡 240

B3 內(nèi) 0 P3 內(nèi) 0.24

外 144 外 176

餡 200 餡 280

B4 內(nèi) 9.6 P4 內(nèi) 6.4

外 — 外 —

餡 — 餡 —

注：“—”表示該部位固體培養(yǎng)基上的菌落數(shù)過多無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，樣品內(nèi)部的細(xì)菌含量極少，樣品表面的細(xì)菌含量較之肉內(nèi)細(xì)菌含量增加很多，肉餡中細(xì)菌含量最多，多數(shù)肉餡樣品中細(xì)菌的含量用肉外樣本同樣的方法已經(jīng)無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。肉內(nèi)幾乎不接觸環(huán)境細(xì)菌，肉表面暴露在運(yùn)輸及銷售環(huán)境中，而肉餡要接觸絞肉機(jī)，同等質(zhì)量下肉餡與環(huán)境接觸的面積最大。因此推測生鮮肉及肉餡中的細(xì)菌來自環(huán)境，包括屠宰、運(yùn)輸及銷售環(huán)境。

2.2 16S rRNA序列分析

成功獲得的111株細(xì)菌基因組DNA用16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序。同源性分析的結(jié)果顯示33株分離自大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基的細(xì)菌全部屬于Escherichia/Shigella屬；40株分離自金黃色葡萄球菌的顯色培養(yǎng)基的細(xì)菌中32株屬于Macrococcus屬、5株屬于Staphylococcus屬、3株屬于Aeromonas屬；38株分離自沙門氏菌選擇培養(yǎng)基的細(xì)菌中有31株屬于Aeromonas屬、6株屬于Enterobacter屬、1株屬于Kluyvera屬。

16S rRNA序列分析結(jié)果表明，除大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基上分離出的細(xì)菌屬于Escherichia/Shigella屬外，金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的細(xì)菌經(jīng)鑒定均不是上述2種細(xì)菌。根據(jù)培養(yǎng)基說明書并結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在某種相似細(xì)菌居多、目的細(xì)菌過少的情況選擇性培養(yǎng)基的假陽性率增加。所以有關(guān)細(xì)菌的分離鑒定，需要在顯色培養(yǎng)的基礎(chǔ)上增加生理生化分析或分子生物學(xué)的方法進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

2.3 分離菌株的耐藥表型檢測結(jié)果

由表3所示，菌株對四環(huán)素、紅霉素、恩諾沙星以及萬古霉素的耐藥更嚴(yán)重，有100株（90.1%）對四環(huán)素非敏感；109株（98.1%）對紅霉非敏感；94株（84.7%）對恩諾沙星表現(xiàn)為非敏感；96株（86.5%）對萬古霉素非敏感。菌株對其他抗生素的耐藥情況也不可忽視，有52株對慶大霉素非敏感；75株對頭孢氨芐非敏感；71株對鏈霉素非敏感，非敏感率分別為46.8%、67.6%以及64.0%。除對慶大霉素的非敏感率低于50%，菌株對其余抗生素非敏感率均在60%以上。

表 3 分離菌株的耐藥性分布

Table 3 Distribution of antibiotic resistance phenotypes

抗生素類型 名稱 敏感 非敏感

耐藥 中介 總數(shù)

數(shù)量 百分比/% 數(shù)量 百分比/% 數(shù)量 百分比/% 數(shù)量 百分比/%

四環(huán)素類 四環(huán)素 11 9.9 100 90.1 0 0.0 100 90.1

氨基糖苷類 慶大霉素 59 53.2 33 29.7 19 17.1 52 46.8

鏈霉素 40 36.0 55 49.5 16 14.4 71 64.0

β-內(nèi)酰胺類 頭孢氨芐 36 32.4 43 38.7 32 28.8 75 67.6

糖肽類 萬古霉素 15 13.5 88 79.3 8 7.2 96 86.5

氟奎諾酮類 恩諾沙星 17 15.3 55 49.5 39 35.1 94 84.7

大環(huán)內(nèi)酯類 紅霉素 2 1.8 92 82.9 17 15.3 109 98.2

2.3.1 不同來源鮮肉中菌株的耐藥表型檢測結(jié)果

在培養(yǎng)成功的111株細(xì)菌中，其中有83株分離自北京大型超市中銷售的生鮮肉；28株分離自北京農(nóng)貿(mào)市場中銷售的鮮肉。分離自市場鮮肉中的細(xì)菌有26株（92.6%）對5種及以上的抗生素表現(xiàn)為非敏感，有5株（17.9%）對所檢測的7種抗生素表現(xiàn)為非敏感；分離自超市中出售的鮮肉中的細(xì)菌，其中54株（65.1%）對5種及以上的抗生素非敏感，27株（32.5%）表現(xiàn)為全部非敏感（圖1）。

2.3.2 不同種類鮮肉中菌株的耐藥表型檢測結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所分離并成功培養(yǎng)的111株細(xì)菌中，其中有53株分離自豬肉及肉餡；有58株分離自牛肉及肉餡。其中分離自豬肉的菌株中有37株（69.8%）對5種及以上的抗生素非敏感，有17株（32.1%）對實(shí)驗(yàn)用7種抗生素全部非敏感。分離自牛肉的細(xì)菌有45株（77.6%）對5種及以上的抗生素非敏感，有7株（12.1%）菌對實(shí)驗(yàn)用的7種抗生素變現(xiàn)為全部非敏感（圖1）。

圖 1 不同來源及種類鮮肉中分離得到細(xì)菌的耐藥表型

Fig.1 Antibiotic resistance phenotype of bacteria from beef and pork from different commercial sources

耐藥表型結(jié)果顯示，目前生鮮肉中分離得到的細(xì)菌對常見抗生素耐藥十分嚴(yán)重且分布廣泛。實(shí)驗(yàn)分離得到的111株細(xì)菌除慶大霉素以外，對其他6種抗生素的非敏感率均達(dá)到了50%以上。對四環(huán)素及紅霉素的非敏感率甚至達(dá)到了90%以上，而四環(huán)素和紅霉素也正是獸醫(yī)的常用抗生素?？股卦陴B(yǎng)殖業(yè)中的用途廣泛，除去治療感染性疾病以外，還可以用于常規(guī)的預(yù)防性治療、養(yǎng)殖廠的消毒、甚至用于促進(jìn)牲畜的生長。這種常年的、較低濃度的抗生素使用狀態(tài)，勢必會導(dǎo)致較高的選擇性壓力[19]，促進(jìn)細(xì)菌的耐藥進(jìn)程。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，市場樣品中分離的細(xì)菌對5種及5種以上抗生素的耐藥率要高于超市樣品，說明市場環(huán)境中的細(xì)菌無論是耐藥表型還是耐藥基因的數(shù)目都要高于超市中的細(xì)菌。這樣的結(jié)果可能與市場環(huán)境復(fù)雜、消毒措施簡陋、對銷售人員管理不嚴(yán)有一定的關(guān)系。但是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在某個超市樣品（無論是豬肉還是牛肉）中分離的Escherichia屬細(xì)菌對7種抗生素全部耐藥。推測這可能是由于一株或幾株高耐藥的Escherichia污染所造成的。雖然超市的生鮮區(qū)銷售環(huán)境較之市場要相對整潔，但是由于處于半密閉的環(huán)境，造成單個或少數(shù)耐藥細(xì)菌大面積污染的幾率比市場更高。因此，無論是超市還是市場都應(yīng)該嚴(yán)格控制生鮮區(qū)的衛(wèi)生狀況，相關(guān)監(jiān)管部門也應(yīng)加強(qiáng)日常的監(jiān)督和管理。

2.4 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

2.4.1 不同耐藥基因的分布情況

在111株培養(yǎng)成功的菌株中，83個菌株中檢測到115個耐藥基因，檢出率高達(dá)74.8%，其中檢測到2個erm B基因、16個tet K基因、4個tet M基因、57個tet O基因、36個tet L基因，沒有檢測到erm B、tet S、tet Q以及tet W基因。有11株（9.6%）菌同時攜帶3個不同的耐藥基因，8株（7.0%）菌同時攜帶2個不同的耐藥基因（圖2）。隨機(jī)挑選了50個PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，所有擴(kuò)增產(chǎn)物均為目的耐藥基因。

圖 2 不同耐藥基因分布情況

Fig.2 Distribution of different kinds of ARGs

2.4.2 不同來源鮮肉中菌株的耐藥基因分布情況

在超市購買的鮮肉中分離得到83株細(xì)菌，其中有54株菌檢測到66個耐藥基因，紅霉素耐藥基因1個；四環(huán)素耐藥基因65個。攜帶2個及2個以上耐藥基因的菌株有9株占總數(shù)10.8%。市場中購買的鮮肉中分離得到28株細(xì)菌，檢測到1個紅霉素耐藥基因，45個四環(huán)素耐藥基因，分別屬于27株細(xì)菌；攜帶2種及2種以上耐藥基因的菌株有10株，占總數(shù)35.7%（圖3）。

2.4.3 不同種類鮮肉中菌株的耐藥基因分布情況

圖 3 不同來源及種類鮮肉中分離得到細(xì)菌的耐藥基因分布

Fig.3 Distribution of ARGs among bacteria from different commercial sources and species of meat

從豬肉中分離得到的細(xì)菌共檢測到53株含有56個耐藥基因，至少攜帶一種耐藥基因的菌株有37株，檢出率為69.8%；攜帶2種及2種以上耐藥基因的菌株有12，占總數(shù)22.6%；牛肉中分離得到的58株細(xì)菌的檢出率則為77.5%，包括1個紅霉素耐藥基因、55個四環(huán)素耐藥基因，攜帶2種及2種以上耐藥基因的菌株有7株，占總數(shù)12.1%（圖3）。

市場樣品中分離的細(xì)菌攜帶1個或多個耐藥基因的比例均高于超市樣品，這與市場環(huán)境開放及衛(wèi)生條件較差也存在較大關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)檢測的9種耐藥基因中，四環(huán)素耐藥基因tet O檢出率最高，其次是tet L、tet K以及tet M，其中多數(shù)tet O基因來自Aeromonas以及Escherichia菌屬，它們均屬于Enterobacteriaceae科，多數(shù)該科細(xì)菌是動物以及人類腸道中常見種類，而腸道內(nèi)以及環(huán)境中四環(huán)素耐藥基因又有很高的豐度[20]。因此，推斷從鮮肉中分離的攜帶tet O基因的細(xì)菌可能來自屠宰或加工過程中糞便中細(xì)菌的污染；tet L、tet K以及tet M基因多來自Macrococcus屬細(xì)菌，且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對四環(huán)素普遍耐受。因該屬多分離自牛肉、牛奶及動物皮膚表面，推測其耐藥性及耐藥基因可能來自于牲畜的飼養(yǎng)過程。雖然，實(shí)驗(yàn)分離的所有111株細(xì)菌對紅霉素的耐藥率高達(dá)98.2%，但僅有2株細(xì)菌檢測到了紅霉素erm B基因?，F(xiàn)在已知的紅霉素及其所屬的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素相關(guān)耐藥基因有幾十種，所以，本實(shí)驗(yàn)推測鮮肉中所分離得到的對紅霉素耐藥的細(xì)菌中含有erm A和erm B以外的針對紅霉素的耐藥基因。

3 結(jié)?論

隨著抗生素在豬、牛等養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用，生鮮豬、牛肉中分離得到的細(xì)菌的耐藥情況也日益嚴(yán)重[21]。同時，生鮮肉及其肉餡等制品中有害細(xì)菌的存在對消費(fèi)者的健康有著極大的威脅。雖然，目前市售生鮮肉中分離細(xì)菌的耐藥情況較為嚴(yán)重，但作為消費(fèi)者如果在食用鮮肉之前將其充分加熱，就能很好的殺滅其中的細(xì)菌，這樣就可以減少有害細(xì)菌以及耐藥細(xì)菌對消費(fèi)者身體健康帶來的影響。同時，飼養(yǎng)行業(yè)應(yīng)嚴(yán)格控制以及規(guī)范使用抗生素，降低抗生素對耐藥細(xì)菌的選擇性壓力。相關(guān)部門還應(yīng)加強(qiáng)對生鮮肉品商場衛(wèi)生環(huán)境的監(jiān)管，對市售生鮮肉中細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測。不僅是耐藥表型，同時更應(yīng)重視耐藥基因的監(jiān)管力度，從根本上維護(hù)廣大消費(fèi)者的權(quán)益。

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