杜仲籽粑的深度開發(fā)利用研究

項杰　李剛　孟成英　張孟松

摘要[目的]研究從杜仲翅果中提取亞麻酸之后的籽粑中制備桃葉珊瑚苷及其苷元的工藝方法。[方法]采用硅膠柱層析法從杜仲粕中分離純化桃葉珊瑚苷，優(yōu)化柱層析分離、純化條件，利用酶解技術選擇最佳酶解條件，運用高效液相色譜法（HPLC）對產(chǎn)品進行檢測分析。[結(jié)果]最佳上樣量為2%，使用V（甲醇）∶V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）為4∶0.5∶9的混合溶劑進行洗脫，通過收集、重結(jié)晶可獲純度為97%的桃葉珊瑚苷產(chǎn)品，利用酶解技術在30 min時桃葉珊瑚苷能達到最佳的酶解效果。[結(jié)論]該研究為高效制備桃葉珊瑚苷及其苷元的工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

關鍵詞 桃葉珊瑚苷；桃葉珊瑚苷元；柱層析；純化

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）22-07404-02

桃葉珊瑚苷（aucubin，AU）又名珊瑚木苷，是一種環(huán)烯醚萜苷化合物?，F(xiàn)代藥理學研究表明，桃葉珊瑚苷具有良好的生物活性物質(zhì)，護肝解毒、抗氧化延緩衰老、抗骨質(zhì)疏松和神經(jīng)營養(yǎng)等藥理作用，能促進干細胞再生， 明顯抑制乙型肝炎病毒DNA 的復制，其苷元及有效多聚體是一種強活性的抗菌素[1-4]。因此桃葉珊瑚苷在醫(yī)藥、日用化工和飼料等行業(yè)已得到了廣泛的開發(fā)和應用。研究開發(fā)桃葉珊瑚苷及其苷元的綠色環(huán)保、快速高效的制備方法，具有一定的理論和應用價值。該研究應用超聲波提取法從杜仲粕中提取桃葉珊瑚苷，采用柱色譜及重結(jié)晶法分離純化取桃葉珊瑚苷和β葡萄糖苷酶催化水解桃葉珊瑚苷法制備苷元，為工業(yè)化制備桃葉珊瑚苷及其苷元提供科學、合理的試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。LC10ATVP二元泵（島津公司），ClassVP液相色譜工作站（島津公司），Rheodyne7725進樣器（美國），SPDM10AVP二極管陣列檢測器（島津公司），MilliQ超純水裝置，AT130柱溫箱（天津），AB104N電子天平（Mettlertoledo公司），2200B超聲波儀。

1.1.2 試劑。甲醇（色譜純，山東禹王試劑公司），乙醇、二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、磷酸等試劑均為分析純（分析純，天津市百世化工公司化學試劑廠），水為重蒸水并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾；硅膠G（青島海洋化工廠），桃葉珊瑚苷（中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%，批號111761-200601）、桃葉珊瑚苷元對照品（成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，批號MUST-20110526）。

1.1.3 藥材。杜仲粕原料為湘西和益生物科技有限公司在2011年3月從杜仲翅果中提取亞麻酸之后的粕。

1.2 試驗方法

1.2.1 HPLC檢驗方法。采用文獻報道的HPLC方法[5]進行檢測。色譜條件為USA UL TRASPHERS ODS dp柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（3∶97），檢測波長206 nm，流速1.0 ml/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μl。

1.2.2 桃葉珊瑚苷提取方法。通過預試驗確定最佳提取方法，即杜仲粕適量，加8倍量的80%乙醇，用保鮮膜密封并放置冰箱中12 h，取出放至室溫，超聲提取3次，每次30 min（保持水溫35 ℃左右），合并提取液，于55 ℃以下減壓濃縮并回收乙醇，濃縮液放置冰箱中保存，備有。

1.2.3 硅膠吸附量的研究方法。 稱取處理好的硅膠1 g，共7份，分別置于100 ml具塞三角瓶中，精密加入0.03、0.10 、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 ml的濃縮液并加入少量水，使瓶中水溶液的量均為0.60 ml，然后分別精密加入甲醇～石油醚～乙酸乙酯液（4∶0.5∶9 ）20 ml，置于25 ℃的恒溫水浴中振搖15 min，取出，備用。

1.2.4 平衡常數(shù)的研究方法。 稱取處理好的硅膠1 g，共7份，置于100 ml具塞三角瓶中，分別加入0.01 ml的濃縮液（桃葉珊瑚苷的量為0.429 mg），按照“1.2.3”的方法進行測定吸附平衡常數(shù)試驗。

1.2.5 硅膠柱色譜的分離純化。 稱取10 g處理好的硅膠，加入甲醇∶石油醚∶乙酸乙酯（4∶2∶9）液濕法裝柱（45×1.5 cm），測得柱中死體積約為95 ml，量取“1.2.2”的濃縮液4.7 ml依次加入5 g處理好硅膠拌勻后，干法上樣，依次采用甲醇∶石油醚∶乙酸乙酯（4∶2∶9）、（4∶1∶9）、（4∶0.5∶9）不同比例進行洗脫，每個梯度洗脫10倍柱體積，收集濃縮，測定。

1.2.6 桃葉珊瑚苷最佳水解時間的研究。 精密稱取β葡萄糖苷酶10 mg，加入50 ℃的水2 ml，在磁力攪拌下活化10 min，然后加入桃葉珊瑚苷30 mg進行酶解，在酶解過程中溶液的顏色由淺黃色變?yōu)樯铧S色，最后溶液顯綠色。分別在0、30、40、50、60 min用移液槍取20 μl酶解液，并以未加酶的桃葉珊瑚苷水溶液在相同的試驗條件下做空白，分別點于同一硅膠板上，以甲醇～石油醚～乙酸乙酯（2∶2∶5）為展開劑，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，于105 ℃下加熱3～5 min至斑點顯色清晰。