環(huán)境因素對(duì)節(jié)桿菌株Ha1降解阿特拉津效果的影響

魏曉愛(ài)等

摘要[目的]明確菌株Ha1降解阿特拉津（AT）的最適環(huán)境因素。[方法]采用液相色譜法測(cè)定降解體系中阿特拉津的殘留量。[結(jié)果]K+和Mg2+對(duì)菌株Ha1降解阿特拉津有促進(jìn)作用，Cu2+、Cd2+等離子則抑制其降解功能的發(fā)揮；溶液的緩沖性、pH、溫度、供氧方式、反應(yīng)體系、菌株的濃度和氰尿酸（CA）對(duì)菌株 Ha1降解阿特拉津有影響。[結(jié)論]該研究結(jié)果為生物修復(fù)被阿特拉津污染的水環(huán)境奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞阿特拉津；Arthrobacteria sp.Ha1；降解速率

中圖分類號(hào)S451.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2014）36-13062-04

Abstract[Objective] It was cleared that the optimum environmental factors of strain Arthrobacter sp.Ha1 biodegradating atrazine.[Method] The atrazine residue in the system was determined with liquid chromatography.[Result] Atrazine biodegradation was significantly promoted by the addition of K+ or Mg2+and significantly restrained by the addition of positive ion such as Cu2+ and Cd2+.The atrazine degraded by strains Ha1 was affected by metal ion， pH， temperature， oxygen， cell concentrations and cyanuric acid.[Conclusion] The results laid the theoretical foundation for bioremediation of atrazine contamination in the water environment.

Key wordsAtrazine； Arthrobacter sp.Ha1；Degradation rate

阿特拉津（C8H14ClN5，Atrazine，簡(jiǎn)稱AT），又名莠去津，化學(xué)名稱為2氯4乙胺基6異丙胺基1，3，5三嗪，是一種半衰期長(zhǎng)的三嗪類除草劑[1]。因其可移動(dòng)性強(qiáng)，在河流、地下水、地表水中常?？梢詸z測(cè)出阿特拉津的存在[2]。每年有2百萬(wàn)～3百萬(wàn)人在飲用被阿特拉津污染的水[3]。歐洲委員會(huì)在有關(guān)飲用水的規(guī)定中明確指出[4]：任何農(nóng)藥在飲用水中的含量不可超過(guò)0.1 μg/L。1998年我國(guó)規(guī)定Ⅰ、Ⅱ類地表水中阿特拉津的標(biāo)準(zhǔn)為3.0 μg/L[5-7]，而實(shí)際上我國(guó)淮河的4個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的阿特拉津含量都在81.3 μg/L 以上[8]。因阿特拉津?qū)θ诵笪：Υ?，所以控制和治理阿特拉津的污染是世界各?guó)期待解決的問(wèn)題。可以通過(guò)化學(xué)方法修復(fù)阿特拉津的污染，而生物降解的方法因?qū)Νh(huán)境的二次污染小而受到人們的廣泛關(guān)注[9-10]。為此，筆者研究了從土壤中獲得的阿特拉津高效降解菌Arthrobacter sp.Ha1在低營(yíng)養(yǎng)條件下的降解特性及與環(huán)境因素的關(guān)系，旨在為利用Ha1菌株修復(fù)被阿特拉津污染的水體提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.Ha1（簡(jiǎn)稱Ha1），由東北林業(yè)大學(xué)森林病蟲害生物學(xué)國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離及鑒定。

1.1.2試劑與藥劑。阿特拉津原藥由遼寧省營(yíng)口市三征農(nóng)藥廠惠贈(zèng)；除氰尿酸和阿特拉津標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自西格瑪公司外，其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基 （LB）：1 L去離子水中含NaCl 10.0 g、酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨 10.0 g。微量元素：MnSO·H2O 1.00 g、FeSO4·7H2O 1.00 g、H3BO4 0.10 g、NaMoO4·2H2O 0.25 g、ZnCl2 0.25 g、CuCl2·2H2O 0.25 g、Co（NO3）2·6H2O 0.25 g、NH4NO3 0.10 g、NiSO4·6H2O 0.10 g、濃H2SO4 5 ml，定容至1 000 ml。基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（BSM）：KH2PO4 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、NaCl 0.40 g、K2HPO4 179 g、微量元素1 ml、pH7.5，定容至1 000 ml。

1.1.4儀器。Ultrospec 4200 pro型分光光度計(jì)；ER52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Waters 2695型液相色譜儀。

1.2方法

1.2.1殘留阿特拉津的檢測(cè)。

萃取反應(yīng)體系中的阿特拉津（培養(yǎng)液與三氯甲烷的比例為10∶1，V/V），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干提取液，色譜甲醇溶解稀釋殘留物后用HPLC檢測(cè)。檢測(cè)條件：Waters 2996紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm；柱溫25 ℃；流動(dòng)相為水-甲醇（20∶80，V/V）；進(jìn)樣量5 μl ；流速為1 ml/min； 250 mm×416 mm C18不銹鋼色譜柱。阿特拉津保留時(shí)間為1.68 min。以已知濃度的阿特拉津標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸收值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求待測(cè)阿特拉津的濃度。

1.2.2菌液的制備及Ha1對(duì)阿特拉津的降解條件。

1.2.2.1菌液的制備。LB培養(yǎng)基中接種菌株Ha1，150 r/min、30 ℃下?lián)u培48 h，5 000 r/min離心10 min，用滅菌的生理鹽水洗滌2次，懸浮于磷酸鉀緩沖液（50 mmol/L，pH70）中，保存于4 ℃冰箱，備用。

1.2.2.2Hal對(duì)阿特拉津的降解條件。阿特拉津降解體系： 0.5 g/L阿特拉津的MgCl2溶液，接種濃度1.0×107個(gè)/ml，150 r/min、28 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，設(shè)不加菌液的處理為空白對(duì)照，每4～6 h檢測(cè)其降解情況（如無(wú)特殊說(shuō)明，試驗(yàn)皆采用該反應(yīng)體系）。環(huán)境條件對(duì)阿特拉津降解速率的影響：①金屬離子。以0.5 g/L阿特拉津的去離子水為降解體系，加入Mg2+、Fe2+等14種不同的金屬離子，加入菌液使終濃度為1.0×107個(gè)/ml。②pH的影響。配制不同pH的50 mmol/L磷酸緩沖液和非緩沖液（NaOHHCl溶液）（pH為6.0到110），加菌液和阿特拉津。③反應(yīng)體系的影響。用含0.5 g/L阿特拉津 MgCl2和BSM 2種體系，加入菌液使終濃度為1×106、1×107、1×108 個(gè)/ml，定期檢測(cè)Ha1降解情況。④初始Ha1菌液濃度的影響。在MgCl2溶液中分別加入菌液，使終濃度為0、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個(gè)/ml，定期測(cè)定阿特拉津的含量。⑤氧氣的影響。設(shè)置搖床振蕩（150 r/min）、靜置、充氮靜置和充氧靜置4種供氧培養(yǎng)方式，分別加入菌液使終濃度為1.0×107個(gè)/ml，5 d后測(cè)定降解率。⑥溫度的影響。在含0.5 g/L阿特拉津的MgCl2和BSM液體中加入菌液，使終濃度為1.0×107個(gè)/ml，分別置于4、20、25、30、37、45 ℃搖床中搖培，72 h后測(cè)定阿特拉津的降解率。⑦氰尿酸的影響。MgCl2溶液中含有1 g/L阿特拉津、氰尿酸和阿特拉津+氰尿酸的混合液，定期檢測(cè)阿特拉津的含量。

2結(jié)果與分析

2.1金屬離子對(duì)降解的影響

許多金屬離子作為輔基、促進(jìn)因子、抑制因子等參與酶的催化活動(dòng)[11]，微生物降解有機(jī)污染物的能力與金屬離子密切相關(guān)[12-13]。由表1可知，在降解過(guò)程中，菌體自身或者由菌體產(chǎn)生的阿特拉津降解酶可能對(duì)某些金屬離子格外“敏感”， Cu2+、 Cd2+、Co2+等離子對(duì)菌株Ha1降解阿特拉津有抑制作用。其中Cu2+離子的抑制作用最明顯，在0.1 μmol/L時(shí)，降解速率僅為1.940 mg/（L·h），而對(duì)照為3.780 mg/（L·h）。K+、Mg2+等離子對(duì)菌株Ha1降解阿特拉津具有明顯的促進(jìn)作用，其中Mg2+離子促進(jìn)作用最顯著，1.0 mmol/L濃度時(shí)降解速率達(dá)11.310 mg/（L·h），是對(duì)照的3倍。對(duì)比分析K+、Mg2+離子在0.1、1.0、10.0 mmol/L時(shí)Ha1降解阿特拉津的效果，1 000.0 μmol/L是促進(jìn)菌株Ha1降解阿特拉津的最佳濃度。

2.2pH和溫度對(duì)降解的影響

以非緩沖液及磷酸鹽緩沖液為反應(yīng)體系，測(cè)定了pH與降解速率的關(guān)系及緩沖體系對(duì)降解的影響（圖1）。在非緩沖液和磷酸鹽緩沖液2種溶液中菌株Ha1對(duì)阿特拉津的降解速率均表現(xiàn)出隨著pH的增加而先增加后減小的趨勢(shì)，分別在pH7.5和7.0時(shí)達(dá)到最大值，但在緩沖溶液中的最大降解速率僅為1.380 mg/（L·h），而在非緩沖溶液中的最大降解速率為6.30 mg/（L·h），兩者相差3.44倍，表明緩沖溶液對(duì)菌株Ha1降解阿特拉津具有一定的抑制作用。余冰賓報(bào)道[14]磷酸鹽緩沖液會(huì)抑制某些生物化學(xué)過(guò)程，如對(duì)某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制。該研究的結(jié)論與其一致。在磷酸鹽緩沖溶液中菌株Ha1的最適降解pH為8.0，而在非緩沖溶液中的最適降解pH為9.0。溫度對(duì)菌株Ha1的降解率具有顯著影響。菌株Ha1在BSM反應(yīng)體系中，最適降解溫度范圍為25～37 ℃，72 h的降解率可達(dá)到99.55%；而在MgCl2反應(yīng)體系中最適降解溫度為25 ℃，72 h的降解率為72.73%。37 ℃時(shí)，MgCl2反應(yīng)體系抑制菌株Ha1對(duì)阿特拉津的降解，但BSM反應(yīng)體系中由于營(yíng)養(yǎng)成分利于細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，新生細(xì)胞產(chǎn)生的大量水解酶彌補(bǔ)了高溫抑制菌體降解能力的下降，使其降解率仍達(dá)99.92%（圖2）。

2.3反應(yīng)體系及Ha1菌液濃度對(duì)降解的影響

為探索反應(yīng)體系對(duì)降解的影響，分別在BSM培養(yǎng)液和MgCl2溶液中加入1×106、1×107、1×108 個(gè)/ml 3種濃度的菌懸液，結(jié)果表明，BSM降解體系在相同條件下優(yōu)于MgCl2體系。MgCl2溶液中96 h的Ha1降解率為20%～100%，且Ha1菌體數(shù)量基本未增加；而B(niǎo)SM培養(yǎng)液中3種濃度的阿特拉津降解率均達(dá)100%僅需72 h，且隨著菌液濃度的增大降解時(shí)間縮短（圖3）。

一般來(lái)說(shuō)，微生物對(duì)有機(jī)污染物的降解效果與自身的密度和活性有關(guān)[13]。Ha1在細(xì)胞滅活和6種濃度下對(duì)阿特拉津的降解表明，Ha1菌體在0～5×108 個(gè)/ml濃度范圍內(nèi)，對(duì)阿特拉津的降解速率隨濃度的升高而加快，濃度為5×108個(gè)/ml時(shí)降解1 g/L的阿特拉津僅需要36 h，表明Ha1對(duì)阿特拉津具有很強(qiáng)的降解能力，而滅活細(xì)胞幾乎沒(méi)有降解能力（圖4）。進(jìn)一步研究表明，當(dāng)細(xì)胞濃度大于5×108個(gè)/ml時(shí)，隨細(xì)胞濃度的增加降解速率并不增加。

2.4氧氣及氰尿酸對(duì)降解率的影響

為探索氧氣與Ha1降解率的關(guān)系，測(cè)定了不同供氧條件下的Ha1降解率。由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)體系中充滿氮?dú)鈺r(shí)，由于缺乏氧氣阿特拉津幾乎未被降解，說(shuō)明Ha1對(duì)阿特拉津的降解過(guò)程需要氧氣的參與。Ha1靜息細(xì)胞在加氧靜止和空氣供氧條件下對(duì)阿特拉津的降解率無(wú)顯著差異，表明自然供氧完全能夠保障Ha1降解力的發(fā)揮。在搖床自然供氧過(guò)程中，可能由于培養(yǎng)液的搖動(dòng)增加了酶與底物的接觸機(jī)率，使Ha1對(duì)阿特拉津的降解達(dá)到較高的水平。氰尿酸是阿特拉津降解過(guò)程中的中間產(chǎn)物[11]，在降解過(guò)程中氰尿酸的累積必然會(huì)影響菌株Ha1對(duì)阿特拉津的降解。結(jié)果表明，菌株Ha1既可以降解阿特拉津，也可以降解氰尿酸，降解氰尿酸的速度快于阿特拉津，同樣是1 g/L，降解氰尿酸僅為36 h，而降解阿特拉津則需要72 h。菌株Ha1在外源氰尿酸存在的條件下，降解1 g/L的阿特拉津需84 h，表明外源氰尿酸抑制了阿特拉津的降解（圖6）。

3討論

生物對(duì)阿特拉津降解的實(shí)質(zhì)是其合成酶對(duì)阿特拉津的降解，酶作為生物產(chǎn)生的催化劑能催化各種生物化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)速度不僅受到酶和底物濃度的影響，同時(shí)也和溫度、pH、激活劑和抑制劑有關(guān)。蔡寶立等報(bào)道在阿特拉津降解過(guò)程中有3種關(guān)鍵酶：①阿特拉津水解酶（簡(jiǎn)稱AtzA），該酶催化阿特拉津水解脫氯反應(yīng)產(chǎn)生羥基阿特拉津，是一種功能性的金屬酶[11]；②羥基阿特拉津乙胺基水解酶（簡(jiǎn)稱AtzB），具有催化羥基阿特拉津脫酰胺基反應(yīng)而產(chǎn)生N異丙基氰尿酰胺；③N異丙基氰尿酰胺異丙基水解酶（簡(jiǎn)稱AtzC），是一種具有轉(zhuǎn)化N異丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和異丙胺功能的酶。該研究對(duì)金屬離子的測(cè)定結(jié)果表明，K+和Mg2+對(duì)Ha1降解阿特拉津具有促進(jìn)作用，而Cu2+、Cd2+等具有抑制降解的作用，據(jù)此推測(cè)AtzA在Mg2+和K+的存在下其活性得到提高，但Cu2+、Cd2+等離子對(duì)Ha1降解阿特拉津的抑制機(jī)制尚不清楚，具體影響哪種酶的活性有待于進(jìn)一步研究。另外，在未加任何金屬離子的情況下，對(duì)照降解速率仍可達(dá)3.780 mg/（L·h），其結(jié)果與AtzA的特點(diǎn)看似不符。但由于Ha1懸浮于磷酸鉀緩沖溶液中，K+離子的存在可能使降解酶活性得以充分發(fā)揮。Ha1對(duì)阿特拉津的降解需要氧的參與，在厭氧的條件下，酶的活性幾乎完全受到抑制，這一點(diǎn)符合單加氧酶的特性。

胡江等[15]報(bào)道阿特拉津降解菌Exiguobacterium sp.在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的最適降解溫度范圍為25～30 ℃；代先祝等[15]報(bào)道了Pseudomonas sp.在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的最適降解溫度區(qū)間在37～42 ℃，該研究中所使用的降解菌Arthrobacter sp.Ha1無(wú)論是在BSM中還是在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的MgCl2體系中，20～45 ℃都具有良好的降解效果。在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的MgCl2體系中45 ℃、72 h的降解率仍可達(dá)到40%，表明該菌株在修復(fù)營(yíng)養(yǎng)貧瘠的地下水污染方面將具有良好的應(yīng)用前景。

Strong等[17]把來(lái)自假單胞菌ADP菌株的atzA基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，構(gòu)建了工程菌株后用滅活細(xì)胞進(jìn)行了土壤修復(fù)，56 d內(nèi)土壤中阿特拉津降解率為52%。胡江等[18]利用微小桿菌屬（Exiguobacterium sp，BTAH1）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp，AG）降解菌生長(zhǎng)細(xì)胞修復(fù)被阿特拉津污染的土壤，8 d后土壤中阿特拉津的降解率分別達(dá)96.9%和96.4%。該研究中Arthrobacter sp.Ha1在細(xì)胞濃度達(dá)到1×108個(gè)/ml 時(shí)僅48 h BSM體系中的阿特拉津降解率就可達(dá)100%， 而營(yíng)養(yǎng)貧瘠的MgCl2溶液中降解0.5 g/L的阿特拉津也只需84 h，說(shuō)明該菌株具有更強(qiáng)的降解能力。

在該試驗(yàn)選擇的細(xì)胞濃度和MgCl2溶液降解體系未觀察到生物量增加，細(xì)胞基本上處于靜息狀態(tài)。菌株Ha1靜息細(xì)胞能降解阿特拉津和氰尿酸的混合物，但氰尿酸在一定程度上抑制Ha1對(duì)阿特拉津的降解。氰尿酸作為阿特拉津降解的中間產(chǎn)物，氰尿酸的降解是由AtzD酶來(lái)完成的[11]。Ha1靜息細(xì)胞成功降解阿特拉津?yàn)楣潭ɑ?xì)胞大規(guī)模降解阿特拉津奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]

任登洲， 高小朋， 賀曉龍，等.阿特拉津降解菌的篩選及降解性能研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：306-309.

[2] 王東，冬田芹，趙繼紅.環(huán)境水體中痕量阿特拉津的檢測(cè)[J].北方工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 16（3）：32-36.

[3] KLIGERMAN A D，DOERR C L， TENNANT A H，et al.Cytogenetic studies of three trianzone herbicides.invitro studies[J].Mutation Research，2000，456（4）：53-59.

[4] 蘇少泉.除草劑作用靶標(biāo)與新品種創(chuàng)制[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：268.

[5] BUSTER H R. Atrazine and others triazine herbicide in lakes and rains in Switzerland [J]. Environmental Science Technology，1990，24（1）：1049-1058.

[6] FISCHER I T， VEESER A， HOFFMANN R W，et al. Morphological effects of acute and chronic atrazine exposure in rain bowtrout [J].Archives of Environmental Contamination Toxicology，1991，20（5）：454-461.

[7] KOLPIN D W， SNECK D A，HALLBERG G R，et al. Temporal trends of selected agricultural chemicals in Iowa's groundwater，1982-95：Arethings getting better[J].Environ Qual，1996，26（3）：1007-1017.

[8] 王子鍵，呂怡兵，王毅，等.淮河水體取代苯類污染及其生態(tài)污染[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2002，22（3）：300-303.

[9] STRONG L C，MCTAVISH H， SADOWSKY M J，et al. Fieldscale remediation of atrazinecontaminated soil using recombinant Escherichia coli expressing atrazine chlorohydrolase [J].Environmental Microbiology，2000， 367（2）：91-98.

[10] 胡江等，胡江，代先祝，等.兩株降解菌對(duì)阿特拉津污染土壤的修復(fù)效果研究[J].土壤學(xué)報(bào)，2005，42（3）：323-328.

[11] 蔡寶立， 黃今勇.除草劑阿特拉津生物降解研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展， 1999， 19（3）：7-10.

[12] NEWCOMBE D A， CROWLEY D E.Bioremediation of atrazinecontaminated soil by repeated applications of atrazinedegrading bacteria [J].Applied Microbiology and Biotechnology， 1999，51（6）：877-882.

[13] 陳東之， 陳建孟， 章晶曉，等.環(huán)境因素對(duì)甲基叔丁基醚生物降解的影響研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 27（9）：1463-1469.

[14] 余冰賓.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：清華大學(xué)出版社，2004：165.

[15] 胡江，代先祝，李順鵬.阿特拉津降解菌 BTAH1 的分離與鑒定[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2004， 24（6）：738～742.

[16] 代先祝，蔣建東，顧立峰，等.阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.AG1降解基因研究[J].生物工程學(xué)報(bào)， 2007， 9（5）：789-794.

[17] STRONG L C， ROSENDAHL C，JOHNSON G，et al. Arthrobacteraurescens TC1 metabolizes diverse s-triazine ring compounds [J].Applied and Environmental Micorobiology，2002，68（12）：5973-5980.

[18] 胡江，代先祝，李順鵬.阿特拉津及其降解菌的使用對(duì)土壤微生物群落的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（8）：1518-1522.