瓜類及蔬菜等植物病原細菌抗銅機制研究進展

李強 楊玉文 孫柏欣 王鐵霖 趙廷昌 胡俊

摘 要： 銅素殺菌劑是一類主要用于防治細菌性病害的殺菌劑，特別是防治瓜類細菌性果斑病的主要殺菌劑，然而由于此類殺菌劑的廣泛使用，使細菌的耐藥性隨之增強。對近幾年闡述較為清晰的幾種細菌的抗銅機制進行概述，主要包括Cop系統(tǒng)、Cut系統(tǒng)、Pco系統(tǒng)、Cus系統(tǒng)、P型ATP酶排出系統(tǒng)、非ATP酶排出系統(tǒng)和多聚磷酸鹽參與的銅外排系統(tǒng)，旨在為瓜類細菌性果斑病抗銅機制研究和科學使用銅素殺菌劑提供參考。

關(guān)鍵詞： 瓜類細菌性果斑?。?殺菌劑； 抗銅機制

Advances in Copper Resistant Mechanisms of Cucurbit and Vegetable Pathogenic Bacteria

LI Qiang1，2， YANG Yu-wen2， SUN Bai-xin2， WANG Tie-lin2， ZHAO Ting-chang2， HU Jun1

（1. College of Agronomy， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China； 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： Copper is a bactericide used for preventing bacterial diseases, especially in the prevention of watermelon bacterial fruit blotch（BFB）. However，wide use of copper chemicals has enhanced bacteria to develop tolerance to copper. The research of copper tolerance genes and mechanism of copper tolerance in bacteria are summarized in this paper. We mainly describe cop system，cut system，pco system，cus system，P type ATPase removal system，non-P type ATPase removal system and polyphosphates removal system in this article. We want to provide references for further study of copper tolerance mechanisms of BFB and the rationale of proper use of copper bactericides.

Key words： Bacterial Fruit Blotch； Bactericides； Copper tolerance mechanisms

銅是細菌維持正常新陳代謝所必需的元素，微量的銅是細菌中一些酶不可或缺的成分，如細胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶和賴氨酸氧化酶等。但是，當銅濃度過高時，會對細菌產(chǎn)生毒害作用，因為銅能參與細胞生化反應產(chǎn)生活性氧簇，破壞細胞內(nèi)的金屬鍵與金屬平衡，它還能與生物大分子如蛋白質(zhì)等結(jié)合，影響其正常的生理功能及活性[1]。因此，利用銅對細菌的毒害作用，研制出了銅素殺菌劑。銅素殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中是一類重要的殺菌劑，隨著該類殺菌劑的廣泛使用，特別是由于一些耐銅菌株的出現(xiàn)[2]，導致銅素殺菌劑的用量隨之提高，但銅屬于重金屬元素，長期大量使用會積聚于土壤中，破壞土壤微生物群落的生態(tài)環(huán)境，使農(nóng)作物產(chǎn)生藥害，危害人類健康[3-5]。而瓜類和蔬菜對許多藥劑敏感，更加容易發(fā)生藥害，尤其是苗期抗藥力弱，用藥應十分慎重。

細菌在長期進化中形成了多種機制來抵抗重金屬離子的毒害，人們對細菌的抗銅機制進行了大量深入的研究，提出了各種解釋。本文主要從細菌對銅的隔離沉積和排出的角度作簡要論述，為深入研究細菌的抗銅機制提供參考和借鑒。

1 隔離沉積模式

隔離沉積模式是細胞通過表達能與銅結(jié)合的蛋白并且將結(jié)合的螯合物轉(zhuǎn)運到一個對細胞沒有毒害的位置，目前Cop系統(tǒng)是細菌通過隔離沉積避免銅毒害的典型模式。

1.1 Cop系統(tǒng)

最早的Cop系統(tǒng)是在Pseudomonas syringaepv. tomato中發(fā)現(xiàn)的。該系統(tǒng)涉及到的6個基因，分別為 CopA、CopB、CopC、CopD、CopR和CopS，其中CopA、CopB、CopC和CopD為結(jié)構(gòu)基因，CopR和CopS為調(diào)節(jié)基因[5-7]。他們所對應的功能蛋白中，CopA和CopB是抗銅所必需的蛋白，負責銅的轉(zhuǎn)運，CopC和CopD協(xié)助CopA和CopB行使抗銅功能。CopA和CopC是細胞周質(zhì)蛋白，能與銅螯合，與銅結(jié)合的化學計量比分別為1 ∶ 11和1 ∶ 1（多肽 ∶ Cu原子），CopA含有豐富的組氨酸，組氨酸的含量決定細菌抗銅性的高低，并且CopA有與銅離子結(jié)合的基本序列Met-X2-Met-X-His-X2-Met。CopC是一個桶狀結(jié)構(gòu)，含有Cu+和Cu2+結(jié)合位點[6-7]。CopB是一個外膜蛋白，有5個8肽序列Asp-His-X2-Met-X2-Met，這一序列也是銅離子結(jié)合位點[8]。CopD為內(nèi)膜蛋白，包含幾個保守的組氨酸和幾個跨膜區(qū)，其功能是負責銅的運輸。Cop系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是由CopR和CopS實現(xiàn)的，CopS是傳感蛋白，位于細胞膜上，CopR是激活蛋白，可與DNA結(jié)合。CopR和CopS調(diào)節(jié)系統(tǒng)是典型的磷酸轉(zhuǎn)移雙組分系統(tǒng)。CopS感受外界銅離子的濃度變化，當濃度超過生理需求時，CopS與銅離子結(jié)合，同時水解ATP，被磷酸化。被磷酸化的CopS結(jié)合在CopR上，激活CopR，使轉(zhuǎn)錄發(fā)生。

2 非ATP酶排出模式

非ATP酶排出模式與ATP酶排出模式的主要區(qū)別在于前者是質(zhì)粒基因編碼的蛋白，該蛋白充當載體將重金屬銅離子通過傳遞運輸排出到細胞外。該模式3種系統(tǒng)（Cut系統(tǒng)、Pco系統(tǒng)和Cus系統(tǒng)）的抗銅機制基本相似。

2.1 Cut系統(tǒng)

Cut系統(tǒng)和Pco系統(tǒng)主要在Escherichia coil中研究的比較多。涉及到的8個基因，分別為：CutA、CutB、CutC、CutD、CutE、CutF、CutR和CutS。其中CutA、CutB、CutC、CutD、CutE和CutF為結(jié)構(gòu)基因，CutR和CutS為調(diào)節(jié)基因[9-10]。CutA和CutB是細胞內(nèi)膜蛋白，參與銅的吸收，CutC為細胞質(zhì)蛋白，在細胞質(zhì)內(nèi)參與銅外排的傳遞，CutD為周質(zhì)蛋白，相當于銅外排的載體。CutC和CutD協(xié)同參與銅的排放，CutE為銅結(jié)合蛋白，參與細胞內(nèi)的的銅結(jié)合；而CutF參與銅的運輸，將銅傳遞至某些酶上的銅結(jié)合位點[11]。Cut系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和Cop系統(tǒng)的調(diào)節(jié)類似，由CutR和CutS組成的磷酸轉(zhuǎn)移雙組分系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)完成（圖1）。

2.2 Pco系統(tǒng)

Pco系統(tǒng)由PcoA、PcoB、PcoC、PcoD、PcoE、PcoR和PcoS構(gòu)成，其中PcoA、PcoB、PcoC、PcoD和PcoE為結(jié)構(gòu)基因，PcoR和PcoS為調(diào)節(jié)基因[12]。PcoA為細胞內(nèi)膜蛋白，與多銅氧化酶的功能類似，含有Arg-Arg基序，可以通過TAT通路將多余的銅從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間[13-15]。PcoB也為細胞內(nèi)膜蛋白，目前認為PcoB可能和PcoA協(xié)同將銅離子運到細胞周質(zhì)。PcoC為細胞質(zhì)內(nèi)的金屬蛋白酶，可以與銅離子結(jié)合，參與細胞質(zhì)內(nèi)銅離子的傳遞[16]。PcoD為內(nèi)膜蛋白，含有8個跨膜區(qū)，負責銅的轉(zhuǎn)運[17]。PcoE為周質(zhì)蛋白，具體功能還不清楚。PcoR、PcoS與CopR、CopS的調(diào)節(jié)機制基本相同，不同的是在PcoR和PcoS同時缺失時，CutR和CutS可代替它們行使該功能，同時調(diào)節(jié)其他與抗銅相關(guān)基因的表達。最初這一系統(tǒng)被稱為PcoARBC，后來發(fā)現(xiàn)，PcoARBC與P. syringae的CopABCD非常相似，因此重新命名為PcoABCD，調(diào)節(jié)基因PcoR和PcoS位于PcoABCD的后面，后來又發(fā)現(xiàn)了PcoE，構(gòu)成了PcoABCDRSE。其中，PcoABCDRS與P. Syringae的CopABCDRS有氨基酸同源性很高（圖 2）。

2.3 Cus系統(tǒng)

Cus系統(tǒng)由CusC、CusF、CusB、CusA、CusR和CusS構(gòu)成，CusC、CusB和CusA編碼的蛋白組成銅的外排泵，屬于Resistance nodulation cell division（RND）家族。CusF屬于細胞周質(zhì)蛋白，有一個固定的銅結(jié)合位點，結(jié)合多余的銅并將其運輸?shù)紺usCBA外排泵上，進而將銅排出到細胞外[18]。2009年，Su等[19]報道了大腸桿菌的CusB晶體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可結(jié)合銅離子，并通過實驗證實CusB能識別并運出銅。CusR和CusS編碼雙組分調(diào)控系統(tǒng)：CusS是位于細胞膜上的組氨酸蛋白激酶，其作用是感應周質(zhì)空間中的銅離子濃度；CusR作為響應調(diào)節(jié)因子，激活CusCFBA的轉(zhuǎn)錄。

3 P型ATP酶排出模式

P型ATP酶是一個轉(zhuǎn)運家族，負責金屬的轉(zhuǎn)運和排出。P型銅轉(zhuǎn)運ATP酶基因由染色體上的抗銅基因編碼[20]，此酶含有一個保守的CPx-（x=C，H，或S）基序[21]，促進銅離子的轉(zhuǎn)運和排出并伴隨ATP水解。

在Pseudomonas putida中有4個編碼P型ATP酶的基因，這4個基因都有磷酸化作用所必須的保守堿基，與一價金屬離子和二價金屬離子的轉(zhuǎn)運和外排有關(guān)[22]。P. putida的抗銅系統(tǒng)也是受一個雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)，該系統(tǒng)由1個陽離子反向轉(zhuǎn)運體和2個金屬結(jié)合蛋白組成。在Enterococcus hirae中，eCopA和eCopB也屬于P型ATP酶，eCopA負責銅的轉(zhuǎn)運，eCopB負責銅的排出[23-24]。在Acidithiobacillus ferrooxidans中，也存在2個編碼銅轉(zhuǎn)運的P型ATPase的基因，分別為afCopA和afCopB[25]（afCopA和afCopB與P. syringae中質(zhì)粒編碼的CopA和CopB名稱相同，但結(jié)構(gòu)和功能不同），進一步分析得到，afcopA存在兩個拷貝，即afcopA1和afcopA2，而其中只有一個基因編碼P型ATPase，這可能是A. ferrooxidans抗銅能力比E. Coil強的原因之一。afcopA1在E. coil中表達后使大腸桿菌的銅抗性增強，這表明afcopA1可能是A. ferrooxidans的一個功能性抗銅基因[26]。而且，在A. Ferrooxidans的生長過程中加入銅離子后，afcopB出現(xiàn)過表達現(xiàn)象，如果將afcopB在E. coil中成功表達后，能夠使其獲得更高的抗銅能力[26]。他們進一步研究發(fā)現(xiàn)，afCopB與其他已被鑒定的負責轉(zhuǎn)運銅的蛋白有特征性同源序列，所以我們推測afCopB也是一個轉(zhuǎn)運銅的蛋白。2008年，Luo等[27]研究發(fā)現(xiàn)， A. ferrooxidans在銅離子存在時afcopA2的表達量比afcopA1高，推測afcopA2可能在銅脅迫應答過程中發(fā)揮更為重要的作用。2013年趙文龍[28]發(fā)現(xiàn)在Acidovorax citrulli中與重金屬轉(zhuǎn)移相關(guān)的P型ATP酶基因有4個，編號分別為：Aave-0034、Aave-0356、Aave-1521和Aave-1815，其中與銅轉(zhuǎn)運較為密切的基因是Aave-0034。

在E. coil中，P型ATPase的表達是由ATPase、多銅氧化酶以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控子CueR共同組成的Cue系統(tǒng)完成[29]。Outten等[30]對E. coil的P型ATP酶基因和多銅氧化酶基因（CueO）的啟動子進行了分析，從中找到了在銅離子存在時與CueR結(jié)合的序列，該序列與銅離子結(jié)合促進Cue系統(tǒng)的完成。在A. ferrooxidans中沒有找到與銅離子結(jié)合的CueR序列，這表明在A. ferrooxidans中可能存在不同的抗銅調(diào)控系統(tǒng)。在Enterococus中，外排ATPase的表達也是受eCopYZ基因組成的雙組分系統(tǒng)調(diào)控調(diào)節(jié)的，eCopY基因編碼阻遏物蛋白，當Cu結(jié)合到eCopZ時，eCopY就被釋放[23-24]。

4 多聚磷酸鹽參與的銅外排系統(tǒng)

多聚磷酸鹽是由正磷酸鹽通過磷酸酐鍵連接而成的線狀多聚物，它的合成是在多聚磷酸鹽激酶（PPK）的催化下，將ATP的末端磷酸轉(zhuǎn)移到多聚磷酸鹽鏈末端，而多聚磷酸鹽外切酶（PPX）可以將多聚磷酸鹽水解為無機磷酸鹽[31]。多聚磷酸鹽有許多生理功能，可以作為ATP的來源、細胞質(zhì)內(nèi)的磷酸鹽庫、金屬離子的螯合劑，并可以緩和細胞內(nèi)的金屬壓力[32]。2003年，Vera等[33]已經(jīng)在A. ferrooxidans中發(fā)現(xiàn)編碼PPK和PPX的這兩種酶的基因序列高度保守。

在Acidithiobacillus spp.中，多聚磷酸鹽充當能量的媒介物來源參與銅的外排 [31]。2004年，Alvarez和Jerez[34]在利用透射電鏡研究A. ferrooxidans時發(fā)現(xiàn)了由多聚磷酸鹽組成的電子致密顆粒。同時，在A. thiooxidans和嗜酸性的古菌Sulfolobus metallicus中也發(fā)現(xiàn)了多聚磷酸鹽顆粒。在研究銅和細胞內(nèi)多聚磷酸鹽的關(guān)系之后發(fā)現(xiàn)A. ferrooxidans在銅離子濃度較高的條件下培養(yǎng)時，細胞內(nèi)的多聚磷酸鹽水平比在正常條件培養(yǎng)時低很多，同時多聚磷酸鹽外切酶活性較正常條件時有所提高，于是可以得出結(jié)論：抗銅能力比較強的菌株，其細胞內(nèi)的多聚磷酸鹽水平較高；在較高銅離子濃度的條件下能夠提高A. ferrooxidans中的PPX的活性，將多聚磷酸鹽分解成無機磷酸鹽單體，無機磷酸鹽單體可以結(jié)合細胞質(zhì)中多余的金屬離子，這些金屬磷酸鹽復合物通過轉(zhuǎn)運蛋白排出到細胞外部；同時多聚磷酸鹽水解會釋放大量的能量，合成的ATP用于金屬磷酸鹽復合物的外排[35]。

5 研究展望

細菌細胞內(nèi)銅濃度升高時，不是單一基因或者機制響應該變化，而是由一套分工細致、緊密協(xié)調(diào)的體系響應該變化，從而將多余的銅從細胞質(zhì)和細胞周質(zhì)中清除，減少其對細菌的毒害作用。

目前，對于細菌銅抗性的研究工作取得了較大進展，發(fā)現(xiàn)了許多與銅抗性相關(guān)的基因，初步預測了相應基因編碼蛋白的表達和調(diào)控，但是完整的代謝調(diào)控過程還不清晰。而且不同細菌的銅抗性基因和機制也不盡相同，所以對細菌銅抗性的研究還有很多工作要做。今后的研究應主要集中在以下幾方面：（1）通過轉(zhuǎn)錄組學研究整個調(diào)控系統(tǒng)的變化；（2）通過對啟動子的研究闡述細胞從接受銅刺激到啟動相關(guān)基因的表達的精確機制；（3）研究不同細菌抗銅機制之間的的聯(lián)系。

6 結(jié) 語

近年來細菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch，BFB）的大面積爆發(fā)給當?shù)毓限r(nóng)造成了巨大的損失，嚴重威脅了西甜瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[36]。目前銅制劑是防治細菌性果斑病的主要殺菌劑[37]，隨著該類殺菌劑的廣泛使用，環(huán)境中的重金屬污染日益嚴重，由于微生物細菌易變異和適應性強的特點，致病菌產(chǎn)生了抗重金屬的能力，而且由此導致的致病性也進一步增強；由于許多致病菌的抗性基因即是毒力基因，因此，通過對病原菌重金屬解毒機制的研究來探索其毒力機制，將有助于瓜類細菌性果斑病的有效防治。

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收稿日期： 2014-03-07； 修回日期： 2014-03-25

基金項目： 公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003066）； 國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項（CARS-26）； 中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程

作者簡介： 李 強，男，在讀碩士生，研究方向：植物病害綜合治理。電子信箱： 405450149@qq.com

通信作者： 胡 俊，男，教授，植物病害綜合治理。電子信箱： hujun6202@126.com

趙廷昌，男，研究員，分子植物病理學。電話：010-62815933； 電子信箱： tingchangzhao@gmail.com