太湖稻區(qū)32個(gè)水稻品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析

鈕玉偉等

摘要[目的]采用SSR標(biāo)記構(gòu)建太湖稻區(qū)16個(gè)常規(guī)粳稻品種和16個(gè)雜交水稻品種DNA指紋圖譜并進(jìn)行遺傳多樣性分析。[方法]以篩選出的12對(duì)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好且在染色體上分布均勻的引物作為核心引物，構(gòu)建太湖稻區(qū)32個(gè)主要栽植水稻品種DNA指紋圖譜，以NTSYS-PCV2.10軟件分析遺傳多樣性。[結(jié)果]12對(duì)SSR引物在32份材料中共擴(kuò)增出了47個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物4.7個(gè)，變幅2～6個(gè)；12對(duì)引物的多態(tài)性頻率（FP）平均值為0.627，變幅0.266～0.833；以遺傳相似系數(shù)0.74為閾值可將供試32個(gè)水稻品種分成4類。[結(jié)論]太湖稻區(qū)32個(gè)水稻品種遺傳多樣性相對(duì)狹窄。

關(guān)鍵詞SSR；遺傳多樣性；指紋圖譜；水稻

中圖分類號(hào)S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）36-12833-03

Abstract[Objective] The aim of this study was to construct a DNA fingerprinting database of 32 rice cultivars in Taihu lake area， and the genetic diversity was analyzed based on simple sequence repeats（SSR）. [Method] Twelve evenly distributed SSR primer pairs with high polymorphisms and good repeatability were successfully screened to construct the fingerprinting database.[Result] Among the 32 varieties，12 primer pairs had 47 polymorphic locis， and 4.7 polymorphic locis were detected by each SSR primer pair on an average with the range from 2 to 6. Results show that， SSR markers are suitable for using in construction of rice DNA fingerprint with polymorphism differences between the selected varieties. The genetic deversity analyzed by the software of NTSYSpc V2.10 indicated that， 32 rice varieties can be divided into 4 types based on the genetic similarity coefficient of 0.74 threshold. [Conclusion] The genetic diversity of 32 rice cultivars in Taihu lake area is relatively narrow.

Key wordsSSR； Genetic diversity； DNA fingerprint； Rice

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，以DNA分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的品種DNA指紋技術(shù)也飛速發(fā)展，并開始應(yīng)用于品種鑒定等領(lǐng)域[1-2]。利用DNA指紋圖譜鑒別作物品種具有簡(jiǎn)單快捷、重復(fù)性好、對(duì)品種變異鑒別能力靈敏的優(yōu)點(diǎn)，可直接反映生物的遺傳物質(zhì)在DNA分子水平上的差異，甚至可以區(qū)分一些基因組中的微小變異[3]。DNA指紋圖譜具有較高的多態(tài)性和個(gè)體特異性，能夠避免外界的環(huán)境干擾，不受生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的制約，快速、穩(wěn)定及準(zhǔn)確鑒定品種（系），包括表型難以鑒定的品種[4]，為作物育種和種子管理提供極大的便利[5]。

已有學(xué)者利用微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）進(jìn)行部分地區(qū)水稻品種鑒定、指紋庫構(gòu)建、遺傳多樣性分析[6-9]。陳躍進(jìn)等[6]選用55對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物對(duì)23個(gè)水稻品種進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。陳英華等[7]構(gòu)建了東北地區(qū)水稻區(qū)試新品種的DNA指紋圖譜，劉煒等[8]用37對(duì)SSR引物分析了 72個(gè)不同生態(tài)類型秈粳稻品種的遺傳多樣性。筆者采用篩選的12對(duì)水稻SSR引物，構(gòu)建了太湖稻區(qū)主要栽植的32個(gè)水稻品種的DNA 指紋圖譜，以期為太湖稻區(qū)水稻品種鑒定、遺傳資源評(píng)價(jià)及親緣關(guān)系分析提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

32份供試水稻品種為2013年太湖稻區(qū)栽植的水稻品種，在常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所水稻品種展示區(qū)按常規(guī)栽培和管理收獲，材料編號(hào)、品種名稱來見表1。

1.2DNA提取

按照CTAB法提取水稻基因組DNA。操作流程：①研缽中加入100 mg水稻葉子樣品和700 μl CTAB提取液，充分研磨；②轉(zhuǎn)移混合液至1.5 ml離心管中，65 ℃水浴30 min，每隔5 min振蕩混勻；③取出離心管，冷卻到室溫后8 000 r/min離心2 min；④取出離心管，上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，加入等體積氯仿混勻，振蕩10 min；⑤12 000 r/min常溫離心10 min；⑥轉(zhuǎn)移上清液至1.5 ml離心管中，加等體積異丙醇，混勻后靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清液。70%～75%乙醇漂洗沉淀2次，超凈工作臺(tái)上吹干；⑦加ddH2O 50 μl，沉淀DNA溶解后冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

20 μl反應(yīng)液中包括10×PCR buffer、0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模版和0.3 μmol/L ESTSSR引物。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物選用60 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，36 W電泳3 h。參考王風(fēng)格等[9]快速銀染法，稍加修改如下：50%無水乙醇、2.5%冰醋酸組成的固定液固定5 min；雙蒸水快速漂洗1次；0.2%AgNO3溶液染色5 min；1.5%NaOH、0.4%甲醛組成的顯影液顯影；固定液定影。

1.4數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳凝膠上的相對(duì)位置，觀察穩(wěn)定且易于辨別的差異性條帶，選出具有多態(tài)性的引物，記錄并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立其DNA指紋圖譜。統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性頻率（frequency of polymorphism，F(xiàn)P）。用Excel的方法計(jì)算物種間相似系數(shù)（GS）和遺傳距離指數(shù)（D），根據(jù)所得遺傳系數(shù)矩陣用NTSYS2.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1品種DNA指紋庫的建立

對(duì)所有品種的帶型進(jìn)行記錄整理后，將12對(duì)SSR 引物產(chǎn)生的47個(gè)多態(tài)位點(diǎn)依次排序，形成一個(gè)SSR 數(shù)據(jù)矩陣（表2），建立32個(gè)水稻區(qū)試材料的DNA指紋庫，以區(qū)分供試的每個(gè)品種。12對(duì)引物中RM 1195能鑒別常粳128，RM489能鑒別南粳46、常優(yōu)1218、常優(yōu)2號(hào)，RM5414能鑒別嘉33，RM253能鑒別常優(yōu)4號(hào)，RM337能鑒別南農(nóng)大094240、常優(yōu)1211、常優(yōu)115，其余引物無法單獨(dú)地鑒別某一材料。

3討論

3.1遺傳多樣性分析

根據(jù)DNA指紋的差異程度進(jìn)行遺傳聚類分析，可以掌握品種間的親緣關(guān)系和遺傳距離，以幫助分析品種的特性。該研究所分析的32個(gè)水稻品種，12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性頻率介于0.266～0.833，平均FP值為0.550。表明所選SSR標(biāo)記的多態(tài)性存在較大差異，部分多態(tài)性頻率較小，不利于水稻品種的遺傳多樣性分析和品種鑒定。此外，基于常規(guī)水稻品種的標(biāo)記多態(tài)性頻率平均值為0516，低于雜交水稻品種的標(biāo)記多態(tài)性頻率平均值0.612。該研究檢測(cè)出的47個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目不等，變幅為2～6個(gè)，平均4.7，低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中平均標(biāo)記5. 5個(gè)多態(tài)性片段，其原因可能與該研究所用材料及SSR引物數(shù)較少，遺傳多樣性相對(duì)較低有關(guān)，也可能與材料間遺傳距離小、所用親本相近有關(guān)。

3.2DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫

該研究利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)江蘇太湖稻區(qū)32份水稻材料進(jìn)行了鑒定，聚類分析的結(jié)果反映了材料之間在DNA水平上的相似性。供試材料間遺傳相似系數(shù)都大于0.58，大多數(shù)品種顯示出較近的遺傳距離，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄。部分材料可以單對(duì)引物的特征帶加以鑒別區(qū)分，大部分供試材料必須結(jié)合多對(duì)引物使用，引物之間依靠彼此所能區(qū)分的品種不同，從而組合在一起相互彌補(bǔ)區(qū)分開圖譜庫中的全部品種。聚類分析顯示，寧47為常優(yōu)1216的親本，常糯1號(hào)為蘇虞香粳122的親本，親緣關(guān)系近，不能把它們區(qū)別開。聚類分析中，聚類結(jié)果有一定的地域分布特點(diǎn)，不同地區(qū)的育成品種往往遺傳差異較大，不容易聚在一起；同一單位的育成品種遺傳差異較小，容易歸為一類，如常農(nóng)粳5、6號(hào)、常優(yōu)2號(hào)和常優(yōu)4號(hào)；另外，同一系列水稻品種的遺傳差異也較小，容易聚在一起，如部分常優(yōu)系列品種聚為一小類，但也可能歸于其他類群中，這可能是不同品種親本的遺傳差異較大所致。

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