NaCl預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下水稻H2O2含量和過(guò)氧化氫酶活力的影響

高宇等

摘要

[目的]通過(guò)對(duì)水稻苗前期鹽的處理后，測(cè)定鹽脅迫條件下生理指標(biāo)的變化，確定鹽害對(duì)水稻的影響。[方法] 測(cè)定了一種鹽敏感水稻品種（麗江新團(tuán)黑谷）經(jīng)過(guò)低濃度鹽脅迫預(yù)處理后在鹽害條件下葉片和根中活性氧H2O2的產(chǎn)生和CAT活力。[結(jié)果] 50 mmol/L鹽脅迫能導(dǎo)致其葉片和根中H2O2含量顯著上升，而CAT活力則顯著下降。經(jīng)過(guò)低濃度鹽（20 mmol/L）預(yù)先處理的水稻在鹽脅迫下H2O2含量上升幅度則較小，而CAT活力較高。此外，鹽脅迫預(yù)處理的水稻在鹽害條件下生長(zhǎng)情況更好，其葉片中葉綠素含量更高。[結(jié)論] 活性氧H2O2及其清除酶CAT參與水稻對(duì)鹽害的應(yīng)答反應(yīng)，并且這種預(yù)處理能增強(qiáng)水稻抗鹽害脅迫能力。

關(guān)鍵詞水稻；鹽害；過(guò)氧化氫；過(guò)氧化氫酶；預(yù)處理

中圖分類號(hào)S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）36-12814-02

Effects of NaCl Pretreatment on H2O2 Content and Catalase Activity of Rice under Salt Stress

GAO Yu1，2，XU Chunying1，WANG Dan1， JIN Xuehui1* et al

（1.Agricultural College， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing ，Heilongjiang 163319； 2.Heilongjiang Daqing Academy of Science， Daqing， Heilongjiang 163712）

Abstract[Objective]In order to study the effects of salt injury to rice， based on early rice seedlings after pretreatment of salt， the changes of physiological indexes under salt stress were determine. [Method]The salt sensitive rice variety of LTH was pretreated by low concentration of salt stress. And H2O2 content and catalase activity in the leaves and the roots were studied. [Result] 50 mmol/L salt stress could significantly increase H2O2 content in the leaves and the roots， but significantly decrease CAT activity. The rise of H2O2 content of rice pretreated by low concentration of salt stress （20 mmol/L） was low， but that of CAT activity was high. Otherwise， the growth of the rice pretreated by salt stress under the condition of salt stress was good， and chlorophyll content in the leaves was higher. [Conclusion] H2O2 and CAT were engaged in the response reaction of rice to salt stress. And the pretreatment could improve the salt stress resistance of rice.

Key wordsRice； Salt stress； Hydrogen peroxide； Catalase； Pretreatment

在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，其細(xì)胞在生理活動(dòng)中不可避免地產(chǎn)生活性氧分子，如單線態(tài)氧、超氧陰離子、過(guò)氧化氫以及羥自由基等。這些活性氧會(huì)對(duì)植物的生物大分子造成傷害，但植物在億萬(wàn)年進(jìn)化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基防衛(wèi)系統(tǒng)如抗氧化酶（如清除H2O2的過(guò)氧化氫酶）和大分子抗氧化物質(zhì)（如抗壞血酸等），從而將活性氧自由基的危害降低到最低程度。各種環(huán)境脅迫因子如干旱、鹽害、強(qiáng)光等都能導(dǎo)致植物細(xì)胞中活性氧的過(guò)度產(chǎn)生[1]。我國(guó)有大量鹽堿地，對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)有明顯的危害作用，如抑制植物生長(zhǎng)，作物產(chǎn)量下降。水稻是一種鹽敏感植物，也是我國(guó)主要的農(nóng)作物之一。前人發(fā)現(xiàn)，離體水稻葉片在鹽害作用下H2O2沒(méi)有顯著上升。此外，對(duì)于水稻植物在鹽害條件下H2O2是否會(huì)上升有不同的結(jié)論，如鹽敏感水稻H2O2會(huì)顯著上升，而鹽抗性水稻H2O2上升并不明顯。然而，在自然界中很少有抗鹽水稻品種。這里，筆者對(duì)一種鹽敏感水稻品種（麗江新團(tuán)黑谷）用低濃度NaCl預(yù)處理后，試圖導(dǎo)致其抗鹽能力增強(qiáng)，同時(shí)研究了后天鹽害預(yù)處理的水稻在鹽害條件下，其活性氧如H2O2產(chǎn)量及其主要清除酶過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。該研究工作會(huì)促進(jìn)人們對(duì)水稻在鹽害條件下活性氧代謝產(chǎn)生新的認(rèn)識(shí)。

1材料與方法

1.1植物材料培養(yǎng)及處理

將水稻品種麗江新團(tuán)黑谷先用濃度0.5%次氯酸鈉消毒液處理10 min，然后置于清水中24 h讓其發(fā)芽。接著，轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)土中使其生長(zhǎng)，光照條件為12 h/12 h，75%濕度下生長(zhǎng)。待長(zhǎng)到2片葉后，將一部分水稻幼苗用20 mmol/L NaCl預(yù)處理24 h，對(duì)照為清水處理。然后，將水稻苗重新轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)生長(zhǎng)48 h。挑選健康和大小一致的2種處理后水稻苗（鹽預(yù)處理和對(duì)照處理的）進(jìn)行鹽害（50 mmol/L NaCl）處理24 h，對(duì)照為清水處理。最后，將處理后的水稻苗挑選出來(lái)，用自來(lái)水輕輕沖洗干凈，用于H2O2含量和CAT活力測(cè)定。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葉綠素含量測(cè)定。

葉綠素含量測(cè)定采用丙酮提取，分光光度法測(cè)定[2]。

1.2.2H2O2含量測(cè)定及染色。

利用FOX法測(cè)定H2O2的含量。其原理是在酸性環(huán)境下，氫過(guò)氧化物（包括H2O2）能將Fe2+氧化成Fe3+，后者與二甲酚橙反應(yīng)生成一種紫藍(lán)色的復(fù)合物。該復(fù)合物在560 nm處有最大吸光值。該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性強(qiáng)，靈敏性高[3]。

DAB即二氨基聯(lián)苯胺，能與H2O2在過(guò)氧化物酶催化下生成一種紅棕色物質(zhì)。具體染色步驟為：將葉片浸泡在1 mg/ml DAB溶液中（pH 7.0，DAB事先須溶解在pH 3.8的緩沖液中，低pH環(huán)境有利于DAB完全溶解）。然后，置于有光照的溫室中8 h。將葉片置于濃度95%的沸騰乙醇中脫色5～10 min，可直接看到紅棕色斑點(diǎn)。這就是H2O2與DAB反應(yīng)的產(chǎn)物[4]。

1.2.3CAT酶抽提及測(cè)定。

將植物待測(cè)葉片在液氮中研成粉末，用10倍體積的抽提緩沖液抽提。緩沖液配方如下：01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.5），內(nèi)含濃度1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2。在10 000 g條件下離心20 min，上清液在-20 ℃冰箱中保存，待測(cè)。在1 ml反應(yīng)液（10 mmol/L PBS緩沖液，pH 7.0，10 mmol/L H2O2）中加入適量上述酶抽提液，迅速混勻，在240 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值[5]。蛋白濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[6]。

2結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫對(duì)水稻葉片葉綠素含量的影響

經(jīng)過(guò)水浸根處理和30 mmol/L NaCl浸根處理[7]，分別設(shè)不加100 mmol/L NaCl和加100 mmol/L NaCl處理。由圖1可知，鹽脅迫處理后，經(jīng)過(guò)水浸根處理，分別加100 mmol/L NaCl葉片（C1）與不加100 mmol/L NaCl（C0）葉片比較，葉片中葉綠素含量明顯呈下降趨勢(shì)。而經(jīng)過(guò)水浸根處理與鹽30 mmol/L NaCl浸根處理不加100 mmol/L NaCl處理的葉片（S0）比較，葉片中葉綠素含量依舊呈下降趨勢(shì)，但是隨著鹽脅迫的加強(qiáng)以及時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片（S1）中葉綠素含量反而呈上升趨勢(shì)，甚至超過(guò)C0處理葉片葉綠素含量水平。這說(shuō)明鹽脅迫對(duì)該品種水稻葉綠素含量有較大的影響。

2.2鹽脅迫對(duì)水稻葉片中H2O2含量的影響

研究表明，H2O2含量隨著NaCl脅迫的加大而增加，但是增加趨勢(shì)緩慢，30 mmol/L NaCl浸根處理取得的葉片H2O2含量會(huì)稍低于水浸根處理加100 mmol/L NaCl葉片，30 mmol/L NaCl浸根處理加100 mmol/L NaCl處理的葉片H2O2含量會(huì)稍有增加，但是幅度不大。針對(duì)該試驗(yàn)方案測(cè)試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對(duì)該品種水稻葉片H2O2含量的影響很小[8]。

2.3鹽脅迫對(duì)水稻葉片CAT活性的影響

該試驗(yàn)設(shè)水浸根處理和30 mmol/L NaCl浸根處理，分別設(shè)不加100 mmol/L NaCl和加100 mmol/L NaCl處理，共進(jìn)行4個(gè)處理。由圖2可知，CAT活性大小順序?yàn)镃S0（水浸根處理不加鹽處理）< CS1（水浸根處理加鹽處理）< SS0（30 mmol/L NaCl浸根處理不加鹽處理）< SS1（30 mmol/L NaCl浸根處理加鹽處理）。由此可知，鹽脅迫對(duì)水稻CAT活性有較大的影響，而當(dāng)在鹽脅迫環(huán)境下“鍛煉”后，CAT活性受影響不大，說(shuō)明水稻有一定的耐鹽性[9]

3結(jié)論與討論

鹽脅迫能干擾植物細(xì)胞中活性氧（ROS）產(chǎn)生與清除之間的平衡，導(dǎo)致植物細(xì)胞遭受氧化脅迫傷害。在正常條件下，植物細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS與其清除系統(tǒng)保持這一動(dòng)態(tài)平衡，而當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫而使得產(chǎn)生的ROS量超出其清除能力時(shí)，就會(huì)引起ROS累積產(chǎn)生氧化傷害，導(dǎo)致生物膜脂過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA鏈斷裂及光合受阻等多種有害現(xiàn)象的出現(xiàn)，使得細(xì)胞功能紊亂，機(jī)體出現(xiàn)各種氧化損傷毒害。水稻對(duì)鹽害脅迫相當(dāng)敏感[10-13]。前人研究顯示，抗性水稻品種在鹽害作用下葉片組織中H2O2含量并沒(méi)有顯著的改變。然而，鹽敏感水稻品種在鹽害脅迫下H2O2含量會(huì)顯著上升[14-16]。此外，離體水稻葉片在鹽脅迫下H2O2含量也不會(huì)顯著上升[17]。研究中，麗江新團(tuán)黑谷是鹽敏感品種，鹽害導(dǎo)致其H2O2含量稍有上升。而CAT作為水稻種一種關(guān)鍵的H2O2清除酶，研究中鹽害導(dǎo)致其酶活力顯著下降[18]?？紤]到多數(shù)水稻品種是鹽敏感品種，而我國(guó)又有很大面積的鹽堿地，通過(guò)非轉(zhuǎn)基因手段獲得抗鹽能力的水稻研究顯得很重要。研究中，通過(guò)鹽預(yù)處理該敏感水稻品種，發(fā)現(xiàn)其抗鹽能力獲得顯著增強(qiáng)。這可從生長(zhǎng)狀態(tài)和葉綠素水平獲得驗(yàn)證。此外，H2O2產(chǎn)生量相對(duì)于對(duì)照也稍有上升，而其原因之一可能與其CAT酶活力獲得“鍛煉”，在鹽脅迫條件下能保持較高活力有關(guān)。

綜上所述，對(duì)鹽敏感的麗江新團(tuán)黑谷利用低濃度鹽預(yù)處理后，該水稻品種在較高鹽害條件下其抗性獲得顯著上升。由鹽脅迫誘導(dǎo)的H2O2產(chǎn)生量明顯降低，而且能保持較高的CAT酶活力。該研究可為通過(guò)體外施加化學(xué)試劑增強(qiáng)水稻抗鹽能力提供部分理論依據(jù)。

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