改良獸藥水針劑藥敏試驗(yàn)方法

劉海林　荊汝頂

藥敏試驗(yàn)在治療畜禽細(xì)菌性疾病中發(fā)揮著重要的作用，可以減少因盲目用藥造成的經(jīng)濟(jì)損失。然而很多獸藥專用藥物的藥敏片在國內(nèi)很難買到，且有些獸藥抗生素為復(fù)方制劑，直接購買的藥敏片不能滿足臨床試驗(yàn)需要。經(jīng)過長期實(shí)踐，探索出一種獸藥水針劑的簡易藥敏試驗(yàn)方法。此方法操作簡單能直接反應(yīng)商品化獸藥抗生素對分離細(xì)菌的敏感程度，現(xiàn)以大腸桿菌為例將該方法介紹如下。

1 設(shè)備及材料

1.1 儀器設(shè)備

立式高壓滅菌器，型號為LDZX-30KBS；生化培養(yǎng)箱，型號為250B；電熱恒溫培養(yǎng)箱，型號為DNP-9082BS-Ⅲ；超凈工作臺，型號為SW-CJ-1F型；進(jìn)口10 μL移液器滴頭，生產(chǎn)廠家為AXYGEN公司；0.5-10 μL或0.1-2 μL移液器，芬蘭BIOHIT公司生產(chǎn)；游標(biāo)卡尺或?qū)W生用尺，另外，鑷子、玻璃平皿、500 mL三角瓶、酒精燈、接種棒、醫(yī)用棉簽等購自當(dāng)?shù)蒯t(yī)療器械公司，6 mm打孔器購自當(dāng)?shù)匚木叩辍?/p>

1.2材料

MHA、MHB瓊脂北京陸橋科技有限公司生產(chǎn)，新華一號濾紙，去離子水或蒸餾水為本單位自制，待檢菌株自備。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

MH肉湯（MHB）制備：稱取MHB原粉2.5 g，用100 mL蒸餾水進(jìn)行溶解并測定pH值，若pH值不在要求的7.2-7.4范圍內(nèi)，應(yīng)當(dāng)用HCl或NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)好pH值的MHB放到高壓滅菌器內(nèi)121℃高壓15 min備用。

MH瓊脂（MHA）制備：根據(jù)培養(yǎng)基說明稱取7.6 gMHA瓊脂粉，用200 mL蒸餾水進(jìn)行稀釋，充分溶解后調(diào)節(jié)pH 值，然后121℃高壓15 min。待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時倒入滅菌平皿中，平皿中瓊脂的厚度在4～5 mm為宜，冷卻后的培養(yǎng)基平板要隨機(jī)進(jìn)行無菌抽檢，抽檢合格的瓊脂板放到冰箱2～8℃保存，盡量在一周內(nèi)用完。

2.2 受試菌的制備

將臨床分離好的致病菌用MH肉湯進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后將增菌后的菌液用生理鹽水或MH肉湯稀釋到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫?，備用?/p>

2.3 臨床獸藥水針抗生素準(zhǔn)備

目前臨床上應(yīng)用的獸藥水針抗生素用量上一般為0.05～0.2 mL/（kg·bw），試驗(yàn)前將用量不同的水針用蒸餾水（或規(guī)定的稀釋液）進(jìn)行稀釋，統(tǒng)一到相同用量，如：都轉(zhuǎn)換為0.1 mL/（kg·bw）。然后將統(tǒng)一過用量的藥物裝到干凈滅菌的青霉素小瓶中，貼上制備時間等必要的記錄備用。

2.4 藥敏試驗(yàn)用紙片制備

用6 mm打孔器將新華一號濾紙打成圓形小紙片，然后裝于容器中高壓滅菌后烘干備用。

2.5 改良紙片法操作步驟

2.5.1 用滅菌棉簽浸入到調(diào)整好比濁度的菌液中，將棉簽在容器壁上旋轉(zhuǎn)幾次，除去多余的液體，然后取MHA瓊脂板，用棉簽在瓊脂上劃線均勻涂布，每次旋轉(zhuǎn)60度，整個平板反復(fù)涂擦2次以上，最后用棉簽沿瓊脂邊緣涂抹一圈。如果水分過多可以打開蓋子3～5 min，以便在放置藥敏片之前晾干表面水分。

2.5.2 將滅菌烘干的濾紙片表面用永久性記號筆標(biāo)上數(shù)字編號，每個帶有數(shù)字的紙片對應(yīng)一種待檢水針?biāo)幬?，然后把各紙片均勻放置在平皿上，每兩個紙片的距離在20 mm以上為宜。

2.5.3 用0.1～2 μL移液器吸取準(zhǔn)備好的各種水針?biāo)幬? μL并滴加到對應(yīng)編號的紙片圓心位置。所有藥物滴加完畢后，蓋好平皿靜置3～5 min，使各種液體藥物在紙片上均勻擴(kuò)散開。

2.5.4 然后將平皿倒扣放置于35±2℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育8 h以上，最好孵育16～18 h。

2.5.5結(jié)果判定

達(dá)到要求的培養(yǎng)時間后，檢查接種細(xì)菌生長是否良好，如果生長良好會有融合生長的菌苔出現(xiàn)，藥敏片周圍會出現(xiàn)無細(xì)菌生長的圓圈。如果平板上出現(xiàn)的是單個的菌落，說明配制的菌液過稀或培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不符合細(xì)菌生長要求，這種情況應(yīng)當(dāng)查找原因重新試驗(yàn)。符合判讀要求的平板，用游標(biāo)卡尺在瓊脂板背面量取各藥敏片的抑菌圈直徑，每個抑菌圈量取2次，取2次的平均值作為最終結(jié)果，將結(jié)果填寫到細(xì)菌藥敏試驗(yàn)記錄表上，以便比較各種藥物敏感情況。

通過用標(biāo)準(zhǔn)菌株（大腸桿菌ATCC25922）多次試驗(yàn)證明，成分及含量與包裝上標(biāo)明的相符且用量在0.1～0.2 mL/（kg·bw）的獸藥水針，按照1～1.5 μL/片的含量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果可以參考CLSI規(guī)定的K-B紙片法判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。成分不明或復(fù)方制劑可以通過比較相同試驗(yàn)條件下產(chǎn)生的抑菌圈大小來大概評估各種獸藥的抑菌效果。

3 結(jié)果

通過改良的水針劑藥敏試驗(yàn)方法，可以直接的反映出商品化水針劑對分離細(xì)菌的敏感程度，篩選出敏感性抗生素進(jìn)行有針對性的治療，大大提高了獸醫(yī)臨床上細(xì)菌病的治愈率。

4 討論

由于很多獸藥抗生素目前在國內(nèi)沒有商品化的標(biāo)準(zhǔn)藥敏片（如：氟苯尼考、達(dá)氟沙星等），改良水針?biāo)幟粼囼?yàn)可以直接利用水針劑藥物進(jìn)行試驗(yàn)，通過對不同藥物抑菌圈大小進(jìn)行比較，而篩選出敏感性藥物，解決了因無藥敏片而無法試驗(yàn)的問題。

該方法直接用水針劑進(jìn)行試驗(yàn)，篩選敏感藥物，省去了傳統(tǒng)方法先制作藥敏片的程序，節(jié)省時間。

目前獸藥市場比較混亂，部分獸藥抗生素實(shí)際成分與標(biāo)明的不符，如果用購買的標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏片進(jìn)行試驗(yàn)然后去篩選對應(yīng)的獸藥很可能達(dá)不到預(yù)期的療效，本方法直接用商品化藥物進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出來的藥物針對性更強(qiáng)，療效更顯著。

經(jīng)過實(shí)踐證明，在選擇合適的培養(yǎng)基的條件下，該方法對于一些營養(yǎng)要求較高的苛性細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)效果均很理想。

抗生素耐藥情況與當(dāng)?shù)厥褂每股氐牧?xí)慣有關(guān)，有一定的地域性差別，獸醫(yī)門診可以采用此方法很快評估出新購進(jìn)的水針獸藥在當(dāng)?shù)氐拿舾星闆r，比采用臨床治療加回訪療效的評估的方法所需的時間短、見效快。（編輯：狄慧）