林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生影響因子研究進(jìn)展

曾超 代金玲 白玉娥 呼都特

摘要 林木的體細(xì)胞胚胎發(fā)生是體細(xì)胞在人工無菌培養(yǎng)條件下分化產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的過程，該技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分，不僅在遺傳改良和快速繁殖等方面有著重大意義，也展現(xiàn)出了在實(shí)際生產(chǎn)中良好的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢(shì)。文章綜述了體細(xì)胞胚胎發(fā)生的幾個(gè)重要影響因子——材料、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及培養(yǎng)條件，提出了今后在林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究方面應(yīng)加強(qiáng)對(duì)幼胚的進(jìn)一步分類、胚性愈傷的區(qū)分、控制體細(xì)胞胚胎發(fā)生的同步化等問題的研究。

關(guān)鍵詞 體細(xì)胞胚胎發(fā)生；影響因子；林木

中圖分類號(hào) S722.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-05100-04

林木的體細(xì)胞胚胎發(fā)生是體細(xì)胞在人工無菌培養(yǎng)條件下分化產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的過程。它的相關(guān)研究起源于20世紀(jì)70年代后期。Rao等[1]首次報(bào)道檀香（Santalum album Linn.）的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究。40多年來，全世界已對(duì)50余科180余種木本植物成功地進(jìn)行了體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)并培育出再生植株，其中木本被子植物46科95屬140余種，木本裸子植物7科16屬的50余個(gè)樹種[2]。我國(guó)從事林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的技術(shù)研究起步較晚，目前涉及的樹種有松屬（Pinus）[3]、楊屬（Populus）[4]、云杉屬（Picea）[5]、文冠果屬（Xanthoceras）[6]、葡萄屬（Vitis）[7]、橡膠樹屬（Hevea）[8]等數(shù)10個(gè)樹種。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生有2種途徑：直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生，由外植體直接發(fā)育成體細(xì)胞胚；間接體細(xì)胞胚胎發(fā)生，由外植體脫分化形成愈傷組織，然后愈傷組織再分化產(chǎn)生體胚。大多數(shù)林木樹種都可以通過第1種途徑產(chǎn)生體細(xì)胞胚，其中多以被子植物為主。而針葉樹所屬的裸子植物體胚發(fā)生較難，一般需采用第2種方式產(chǎn)生體細(xì)胞胚。體細(xì)胞胚的直接發(fā)生一般比間接發(fā)生遺傳穩(wěn)定。周麗儂[9]等在園藝植物體胚發(fā)生和植株再生的研究中得出，外植體和培養(yǎng)條件都會(huì)對(duì)植物的體胚發(fā)生造成影響。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生受到多種內(nèi)因和外因的影響，外植體自身個(gè)體的發(fā)育階段和生理狀態(tài)對(duì)林木組織培養(yǎng)成功與否起關(guān)鍵作用，而外植體的生長(zhǎng)和發(fā)育方向由培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度決定[10]。只有合理地調(diào)節(jié)內(nèi)因和外因的作用，才能獲得大量高質(zhì)量的林木體胚。

1 材料

1.1 基因型 基因型是影響林木體細(xì)胞胚發(fā)生的主要內(nèi)因。即使選用大小一致的外植體和相同培養(yǎng)條件來誘導(dǎo)塞爾維亞云杉的5個(gè)品種植物體胚，其體胚誘導(dǎo)率也各不相同，最高可達(dá)18.7%，最低卻只有1.3%[2]。不同基因型的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)頻率差別很大，其原因可能是不同基因型的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)條件存在著較大的差異。姚娜[11]對(duì)10個(gè)表現(xiàn)優(yōu)良的毛白楊基因型進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同毛白楊基因型無論是最佳外植體消毒方法、培養(yǎng)基種類，還是生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度均存在差異。

1.2 外植體 體胚發(fā)生中外植體的篩選是成功的前提。任何細(xì)胞均具有全能性，理論上講，植物體的各類器官，如根、莖、葉、花、種子都可以產(chǎn)生體胚。然而體胚發(fā)生要獲得成功不僅依賴于外植體的來源和選擇部位，也跟外植體的生長(zhǎng)發(fā)育、生理狀態(tài)有很大關(guān)系。Merkle[12]的研究表明，林木的體胚發(fā)生只能選取種子或幼苗進(jìn)行誘導(dǎo)，合子胚或種子的不同發(fā)育時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)體胚的影響很大。分化程度較低的組織是利于體胚誘導(dǎo)的最佳外植體[13]。未成熟合子胚因其細(xì)胞全能性高、脫分化容易，在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生時(shí)具有顯著優(yōu)勢(shì)[14]。

此外，莖尖、葉片也可以作為誘導(dǎo)體胚的外植體。由于葉和莖中的細(xì)胞處于一個(gè)非常復(fù)雜的分化時(shí)期[15]，所以只能用于山杏[16]、懸鈴木[17]之類體胚發(fā)生較為容易的闊葉樹種。

2 培養(yǎng)基

外植體經(jīng)采集，置冰箱中冷藏（4 ℃）備用。試驗(yàn)前用水洗凈，浸泡一定時(shí)間后，用乙醇、次氯酸等試劑滅菌處理后接入培養(yǎng)基。不同種類植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生一般需要選擇不同的培養(yǎng)基。植物組織培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基主要有MS、LM、SH、N6、WPM、DCR、LP等。

2.1 MS培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基是目前使用最為廣泛的培養(yǎng)基。和其他培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基中硝酸鹽、鉀和銨的含量較高。陳金慧[18]等在對(duì)雜交鵝掌楸的體胚研究中發(fā)現(xiàn)，以MS為基本培養(yǎng)基，對(duì)體胚的誘導(dǎo)最為有效。習(xí)洋等[19]也成功以刺槐成熟合子胚為外植體，用MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)出體胚。陳夜江[20]認(rèn)為，在果樹體胚的誘導(dǎo)中，常選用MS培養(yǎng)基，因?yàn)镸S培養(yǎng)基含有較高水平的NH4NO3，對(duì)果樹的體胚發(fā)生有促進(jìn)作用。

2.2 DCR培養(yǎng)基 針葉樹植物體胚誘導(dǎo)需要低濃度NO3-和NH4+，所以含有較低濃度NO3-和NH4+的DCR培養(yǎng)基在針葉樹的組培中應(yīng)用最多[21]。相同激素條件下，DCR培養(yǎng)基對(duì)落葉松體胚的誘導(dǎo)效果明顯好于MS培養(yǎng)基[22]。DCR培養(yǎng)基大量元素含量較少，適合松科植物。李茜等[23]研究表明，將白皮松成熟合子胚接種于DCR培養(yǎng)基上，愈傷生長(zhǎng)迅速，具有較強(qiáng)的分化能力。李清清[24]采用DCR誘導(dǎo)分化黑松未成熟合子胚，成功建立了黑松的體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系。

2.3 其他培養(yǎng)基 培養(yǎng)基種類繁多，不同植物、不同階段所選用的培養(yǎng)基各不相同。MS培養(yǎng)基在云杉屬樹種體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)中起阻礙作用，一般常用LP培養(yǎng)基。相比其他培養(yǎng)基，LP培養(yǎng)基鈣鹽含量較高，可以加速植物體內(nèi)代謝，促進(jìn)生長(zhǎng)。濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生在使用DCR培養(yǎng)基時(shí)的植株再生率只有10%[25]，而使用了LP培養(yǎng)基培養(yǎng)的濕地松植株再生率顯著提高（25.2%）[26]。北美云杉和紅云杉體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基是1/2LM。SH培養(yǎng)基中的有機(jī)成分含量明顯高于LM培養(yǎng)基5倍以上，在沙地云杉體胚研究中有很好的應(yīng)用[27]。WPM培養(yǎng)基在闊葉喬木的初代培養(yǎng)當(dāng)中效果較好。B5培養(yǎng)基是文冠果非胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，在弱光中懸浮培養(yǎng)容易形成體細(xì)胞胚[28]。根據(jù)植物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同合理選擇培養(yǎng)基，是體細(xì)胞胚胎發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。

3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

培養(yǎng)基中附加外源激素和有機(jī)物的種類、濃度及組合對(duì)體胚的誘導(dǎo)、增殖、分化以及發(fā)育都會(huì)產(chǎn)生較大的影響。合理地選擇生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)建立體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系尤為重要。

3.1 外源激素

3.1.1 生長(zhǎng)素。體胚發(fā)生常用的生長(zhǎng)素有2，4.D和NAA。大多數(shù)林木必需在含有2，4.D的培養(yǎng)基下才能誘導(dǎo)體胚發(fā)生。2，4.D可以起到調(diào)節(jié)和平衡內(nèi)源生長(zhǎng)素的作用[28]，在已誘導(dǎo)出體胚的植物中，大約有65%單獨(dú)或與其他激素搭配使用了2，4.D[29]。然而2，4.D的濃度過高對(duì)體胚分化有著不利影響。愈傷組織在含有2，4.D的培養(yǎng)基上長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，容易造成體胚成熟能力的減弱或喪失。一般采取降低濃度繼代或者用作用較弱的NAA替換的方式，這樣有利于體胚的分化和發(fā)育。特別是在增殖培養(yǎng)階段，用NAA代替2，4.D更有利于體細(xì)胞胚的發(fā)生[30]。席夢(mèng)利等[31]研究表明，DCR +6.BA 1.0 mg/L+TDZ 0.003 mg/L+NAA 0.1 mg/L是杉木成熟合子胚誘導(dǎo)體胚的最佳培養(yǎng)基[31]。

3.1.2 細(xì)胞分裂素。細(xì)胞分裂素同樣是影響體胚發(fā)生與植株再生的重要因子。對(duì)于大多數(shù)林木來說，只用生長(zhǎng)素很難誘導(dǎo)出體胚，只有將細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素合理搭配使用才能有效提高體細(xì)胞胚胎發(fā)生概率[10]。一般體胚研究常用的細(xì)胞分裂素有6.BA、KT和ZT。呂秀立等[32]的研究表明，誘導(dǎo)歐洲七葉樹愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+2，4.D 2 mg/L+KT 0.2 mg/L，MS+6.BA 8 mg/L+NAA 1 mg/L有利于胚性愈傷的誘導(dǎo)和增殖，添加ZT 2 mg/L或6.BA 5 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基有利于體胚發(fā)育和成熟。

3.1.3 脫落酸（ABA）。脫落酸（ABA）在體胚的成熟和萌發(fā)方面有重要的影響[10]。以花旗松為例，Taber等[33]在體細(xì)胞胚發(fā)育的刺激階段和成熟階段均使用了ABA。ABA在植物體細(xì)胞胚成熟過程中有著重要的作用[34]。主要表現(xiàn)在以下方面：促進(jìn)體胚分化，提高正常體胚發(fā)生頻率；抑制早熟體胚的發(fā)生，降低不正常體胚的發(fā)生頻率；提高體胚分化的同步化程度[35]。目前，已經(jīng)成功利用ABA分化出白杄、歐洲落葉松、華北落葉松、濕地松等林木體細(xì)胞胚。不同植物種類對(duì)ABA濃度的反應(yīng)不同，0.12～0.15 mg/L的ABA可促進(jìn)橡膠胚性愈傷組織形成體胚[36]，而華北落葉松體胚的成熟培養(yǎng)過程中ABA濃度達(dá)到了19 mg/L[37]。單獨(dú)使用ABA，有可能抑制體細(xì)胞胚發(fā)生[38]。所以進(jìn)一步明確ABA的最佳作用濃度、添加時(shí)間和使用方式，可更好地使用ABA，加速林業(yè)生產(chǎn)。

3.1.4 TDZ。TDZ是新合成的一種雜環(huán)芳香脲，它具有很高的活性，同時(shí)擁有生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的雙重特點(diǎn)。TDZ對(duì)內(nèi)源植物生長(zhǎng)激素起調(diào)節(jié)作用，也可以在誘導(dǎo)逆境中起間接作用，它還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)能量水平等多種作用。到目前為止，TDZ已經(jīng)成功促使近100種組培困難的林木獲得再生植株[39]。有研究表明，TDZ與6.BA搭配使用，可以促進(jìn)北美喬松成熟合子胚不定芽的發(fā)生[40]。其原因可能是6.BA和TDZ在植物細(xì)胞內(nèi)識(shí)別位點(diǎn)和代謝途徑各不相同，從而產(chǎn)生各異的生物學(xué)效應(yīng)。席夢(mèng)利[31]通過杉木的體胚發(fā)生得出結(jié)論，低濃度的TDZ與6.BA配合使用，可以實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)的互補(bǔ)，提高體胚的分化效率。

植物激素穩(wěn)定性也是一個(gè)十分重要的問題。大多數(shù)植物激素難以保持長(zhǎng)久，一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生難溶沉淀，對(duì)體胚發(fā)生造成影響。比如NAA、IBA和KT等3種植物激素在其適宜條件下的保存時(shí)間分別最好不要超過40 d、20 d和40 d[41]。每種激素的保存條件都不盡相同，IBA母液必需遮光保存，KT母液必需低溫并遮光保存等。

3.2 其他添加物質(zhì)

3.2.1 蔗糖、氨基酸。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生同樣會(huì)受到培養(yǎng)基中蔗糖濃度的高低、有機(jī)附加物的使用、滲透劑的添加等因素的影響[42]。蔗糖不僅是培養(yǎng)基中最重要的碳源，也對(duì)培養(yǎng)基的滲透勢(shì)起著調(diào)控作用。氨基酸、水解酪蛋白、香蕉汁等有機(jī)附加物可為培養(yǎng)物提供更易代謝的還原態(tài)氮，這在體胚誘導(dǎo)中有特殊的作用。呂守芳等[43]對(duì)日本落葉松體胚的研究中對(duì)這一推論進(jìn)行了證實(shí)，在體胚誘導(dǎo)、增殖、成熟的培養(yǎng)基中同時(shí)使用了450 mg/L谷氨酰胺和500 mg/L水解乳蛋白，體胚誘導(dǎo)率、體胚增殖率、體胚成熟率分別達(dá)到15.5%、165.2%、10.57個(gè)/g。

3.2.2 活性炭。在培養(yǎng)基中添加活性炭也可以對(duì)植物體細(xì)胞胚的形成和生長(zhǎng)發(fā)育起促進(jìn)作用?；钚蕴靠梢晕郊?xì)胞產(chǎn)生的代謝廢物及培養(yǎng)基中部分激素；在體胚成熟階段，為使胚性胚柄團(tuán)進(jìn)一步發(fā)育，需使用活性炭除去培養(yǎng)基中的2，4.D和6.BA[26]。

3.2.3 聚乙二醇。聚乙二醇（PEG）分子是一種親水性很強(qiáng)的惰性高分子聚合物，它能改變各類細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)，在適當(dāng)?shù)臐舛认拢梢酝ㄟ^脅迫作用降低體細(xì)胞胚中的含水量，有效地調(diào)控體細(xì)胞胚的成熟。唐巍等[26]通過在LP培養(yǎng)基上附加4 mg/L ABA，75 g/L PEG和5 g/L活性炭，使?jié)竦厮傻脑缙谠甙l(fā)育形成了粗壯的子葉胚。

3.2.4 部分離子。部分離子對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生也會(huì)產(chǎn)生影響。以枸杞為例，枸杞的愈傷誘導(dǎo)在加入50 mg/L的AgNO3的培養(yǎng)基上體胚發(fā)生率是不加AgNO3的3倍左右。超過此濃度后，Ag+反而會(huì)抑制枸杞的體細(xì)胞胚發(fā)生[44]。

4 培養(yǎng)條件

植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基本培養(yǎng)方式有3種：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固-液結(jié)合培養(yǎng)。不同的培養(yǎng)方式在體胚發(fā)生中所起的作用都各不相同。體細(xì)胞胚在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)效率和產(chǎn)出質(zhì)量都較高，而液體培養(yǎng)可以改善培養(yǎng)物的供氧情況，提高體細(xì)胞胚產(chǎn)量，易于體細(xì)胞胚的分離、篩選和收集[45]。

將外植體接入培養(yǎng)基后，需放置在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。定時(shí)繼代對(duì)于整個(gè)胚胎發(fā)育過程都很重要。固體培養(yǎng)繼代周期為2～3周，液體培養(yǎng)則最多每隔7 d換液1次[46]。光照、溫度等培養(yǎng)條件對(duì)誘導(dǎo)林木體胚發(fā)生和植株再生起著重要調(diào)控作用。組織培養(yǎng)一般選擇光培養(yǎng)，而胚性愈傷的誘導(dǎo)、增殖和分化大多采用暗培養(yǎng)[47]，溫度22～25 ℃。Gupta等[48]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)光照條件很大程度上與所選用的培養(yǎng)基相關(guān)。挪威云杉成熟胚利用改良1/2MS培養(yǎng)基在24 h光培養(yǎng)下同樣可以誘導(dǎo)出白色半透明的胚性愈傷，然而，多次繼代后，胚性愈傷容易褐化并局部變綠，這對(duì)體胚的后期形成不利[49]。值得注意的是22～27 ℃是胚性愈傷組織最佳的誘導(dǎo)、生長(zhǎng)、分化的溫度，當(dāng)超過30 ℃時(shí)，胚性愈傷組織將會(huì)永久喪失體胚發(fā)生能力。此外，不同階段植物對(duì)光照的需求差異很大，蘋果葉片暗培養(yǎng)更有利于促進(jìn)不定梢再生[50]，而長(zhǎng)時(shí)間光照不足易引起再生苗玻璃化[51]。可見，不同林木體細(xì)胞胚發(fā)生對(duì)于光照、溫度的要求各不相同，不能一概而論，需要逐一進(jìn)行探索。

5 問題與展望

林木的繁殖方法包括枝條扦插、不定芽的形成和體細(xì)胞胚胎發(fā)生3種[52]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑以高繁殖效率和高同步化水平優(yōu)于傳統(tǒng)的種子繁殖和其他的無性繁殖。該領(lǐng)域研究主要在林木的優(yōu)良基因型快速繁殖、基因轉(zhuǎn)化、種質(zhì)保存及突變體篩選等方面呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[53]。我國(guó)的林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究起步較晚，雖然已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍有很多問題需要進(jìn)一步探討。

5.1 幼胚的進(jìn)一步分類 眾多研究表明幼胚是林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的最佳外植體。然而幼胚發(fā)育成成熟胚的時(shí)間較長(zhǎng)，采種期從1～3個(gè)月不等。靳小翠[54]每隔10 d左右采種1次，探討了不同的采種期對(duì)馬尾松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響。DRAGANA STOJICˇIC'更是提出，體胚產(chǎn)生與否只跟外植體的發(fā)育階段有關(guān)，培養(yǎng)條件只影響體胚發(fā)生的誘導(dǎo)率[55]。因此，對(duì)幼胚各個(gè)階段進(jìn)一步分類，尤為必要。

5.2 胚性愈傷的區(qū)分 現(xiàn)如今常規(guī)的區(qū)分胚性愈傷方法是通過制作石蠟切片，根據(jù)體胚細(xì)胞學(xué)特性所表現(xiàn)出的4個(gè)時(shí)期—球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚使用顯微鏡進(jìn)行觀察。然而就體胚形態(tài)學(xué)上的特征眾說紛紜，普遍認(rèn)知為愈傷呈白色絲狀。具體過程為[56]：非胚性愈傷組織的邊緣出現(xiàn)外起源的原胚突起，原胚橫徑方向迅速生長(zhǎng)，胚體發(fā)育成灰白色球形，隨時(shí)間胚體增大增長(zhǎng)，基部產(chǎn)生明顯的下胚軸，中上部也長(zhǎng)出明顯的子葉原基，最終形成具備完整結(jié)構(gòu)的成熟胚。

5.3 控制體細(xì)胞胚胎發(fā)生的同步化 一方面要真正實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚的工廠化和自動(dòng)化生產(chǎn)，滿足優(yōu)良品系擴(kuò)繁及大面積造林的需求，為林業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用開辟一條行之有效的途徑，需要實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的同步化[57]。另一方面人工種子的制作也要求胚狀體形態(tài)大小一致，發(fā)育進(jìn)程相似，即體胚同步，這樣制成的人工種子活力強(qiáng)，萌發(fā)率高[58]。體胚的同步化受到滲透壓、低溫、激素濃度等多個(gè)因素影響，目前只在栓皮櫟[59]、水曲柳[57]、荔枝[60]、龍眼[61]等少數(shù)幾種林木中進(jìn)行過細(xì)胞同步化培養(yǎng)及體細(xì)胞胚發(fā)生同步控制的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] P S RAO，PEGGY OZIAS-AKINS.Plant regeneration through somatic embryogenesis in protoplast cultures of sandalwood （Santalum album L.）[J].Protoplasma，1985.124（1）：80-86.

[2] JAIN S M.Somatic embryogenesis in woody plants[M].Dordrecht：The Netherlands：Kluwer Academic Publishers，1999.

[3] 周韜.白皮松成熟合子胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2010.

[4] 于志水，張志毅，李云，等.楊樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究概況[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，33（1）：60-63.

[5] 楊金玲，桂耀林，郭仲琛.云杉屬樹種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生[J].植物學(xué)通報(bào)，1999，16（1）：59-66.

[6] 顧玉紅，高述民，郭惠紅，等.文冠果體細(xì)胞胚胎發(fā)生[J].植物生理學(xué)通訊，2004，40（3）：311-313.

[7] 楊德翠.釀酒葡萄幼胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

[8] LARDET L，田郎.巴西橡膠樹的次生體細(xì)胞胚胎發(fā)生——一種新的長(zhǎng)期性體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)方法[J].世界熱帶農(nóng)業(yè)信息，2012（8）：1-7.

[9] 周麗儂，曹靜，鄺哲師，等.園藝植物體胚發(fā)生及植株再生技術(shù)研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，1998，19（2）：15-19.

[10] 姚進(jìn).香榧幼胚生物學(xué)特性與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的初步研究[D].杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2012.

[11] 姚娜.不同基因型毛白楊離體再生及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的比較研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2007.

[12] MERKLE S A.Plant tissue culture concept and laboratory exercise[M].Boca Raton，F(xiàn)L：CRC Press，1996.

[13] 崔凱榮，陳克明，王曉哲，等.植物體細(xì)胞胚發(fā)生研究的某些現(xiàn)狀[J].植物學(xué)通報(bào)，1993，10（3）：14-20.

[14] VIKRANT R A.Somatic embryogenesis from immature and mature embryos of a minor millet Paspalum scrobiculatumt L.[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2002，69（1）：71-77.

[15] 蔡曉明.北美二球懸鈴木無性系選育及其體胚發(fā)生等快繁技術(shù)研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué)，2008.

[16] 劉小蕾.山杏的再生體系建立研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[17] 范國(guó)強(qiáng)，黎明，賀窯青，等.懸鈴木體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生[J].林業(yè)科學(xué)，2004，40（3）：71-74.

[18] 陳金慧，施季森，諸葛強(qiáng)，等.雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究[J].林業(yè)科學(xué)，2003，39（4）：49-54.

[19] 習(xí)洋，胡瑞陽(yáng)，王歡，等.刺槐未成熟合子胚的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48（1）：60-69.

[20] 陳夜江，賴鐘雄.果樹和林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究與利用[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，30（3）：420-426.

[21] ELLIS D D，MECABE D E，MELNNIS S，et al.Stable transformation of Picea glauea by particle acceleration[J].Bio Technology，1993（11）：84.

[22] 楊映根， 郭毅， 郭仲琛. 落葉松體細(xì)胞的胚胎發(fā)生[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2003，39（5）：531-535.

[23] 李茜，張存旭，鄭瑞杰.白皮松胚性愈傷組織誘導(dǎo)因素的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21（2）：80-83.

[24] 李清清，葉建仁，吳小芹.黑松合子胚和體細(xì)胞胚發(fā)育階段的形態(tài)特征比較[J].林業(yè)科技開發(fā)，2012，26（5）：21-23.

[25] NEWTON R J. Somatic embryogenesis in Slash pine[M]//JAIN S M， GUPTA P K， NEWTONR J，et al.Somatic embryogenesis in woody plants.Dordrecht：Kluwer Acad Pub，1995：90-108.

[26] 唐巍，歐陽(yáng)藩，郭仲琛.濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生[J].植物資源與環(huán)境，1997，6（2）：8-11.

[27] 張麗媛.沙地云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生組織細(xì)胞學(xué)及光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[28] 顧玉紅.文冠果體細(xì)胞胚胎發(fā)生及形態(tài)建成機(jī)理的研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2005.

[29] GAJ M D.Factors influencing somatic embryogenesis induction and plant regeneration with particular reference to Arabidopsis thaliana（L.） Heynh [J].Plant Growth Regul， 2004，43：27-47.

[30] 賈彩鳳，李悅，瞿超.木本植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)[J].中國(guó)生物工程雜志，2004，24（3）：26-29.

[31] 席夢(mèng)利，施季森.杉木成熟合子胚器官發(fā)生和體胚發(fā)生[J].林業(yè)科學(xué)，2006，42（9）：29-33.

[32] 呂秀立，施季森.歐洲七葉樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究[J].分子植物育種，2003，1（5）：649-654.

[33] TABER R P， CHUN Z， WEI SHOU H. Kinetics of Douglas-fir （Pseudotsuga menziesii） somatic embryo development[J].Canadian Journal of Botany， 1998， 76（5）：863-871.

[34] ATTREE S M，F(xiàn)OWKE L C. Embryogeny of gymnosperms：advances in synthetic seed technology of coniferst[J].Plant Cell Tiss Org Cult， l993，35：1-35.

[35] 王穎，劉春朝，陳秀蘭.ABA促進(jìn)針葉樹體細(xì)胞胚胎分化[J].植物生理學(xué)通訊，2002，38（3）：273-278.

[36] 吳胡蝶，王澤云，陳雄庭.6.BA、ABA對(duì)橡膠花藥體細(xì)胞胚形成及植株再生的影響[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994（3）：1-4.

[37] 齊力旺，韓一凡，李玲，等.華北落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的建立[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，2000，33（4）：357-365.

[38] 高述民，李鳳蘭.ABA對(duì)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)育影響的研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（4）：122-129.

[39] 王關(guān)林，方宏筠，那杰.高活性細(xì)胞激動(dòng)素TDZ在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].植物學(xué)通報(bào)，1997，14（3）：47-53.

[40] MATHUR G， NADGAUDA R. In vitro plantlet regeneration from mature zygotic embryos of Pinus wallichiana A.B.Jacks[J]. Plant Cell Rep， 1999，19：74-80.

[41] 楊秀平.關(guān)于植物組織培養(yǎng)基若干問題的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[42] 王進(jìn)茂，楊敏生，楊文利，等.我國(guó)木本植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究進(jìn)展[J].河北林果研究，2004，3（2）：95-101.

[43] 呂守芳，張守攻，齊力旺，等.日本落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究[J].林業(yè)科學(xué)，2005，41（2）：48-52.

[44] 李杉，戴若蘭，秦芝.枸杞體細(xì)胞胚發(fā)生過程中 Ag+對(duì)痕量金屬離子吸收的影響[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，2001，34（2）：127-130.

[45] YOLANDA Z C P， FLICK A C， LPEZ P G.Somatic embryogenesis in habanero pepper （C.chinense Jacq.） from cell suspensions [J]. Hort Science， 2007，42：329-333.

[46] 江波，楊映根，郭奕明，等.松柏類植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，2004，21（4）：495-505.

[47] 陳金慧，王洪云，諸葛強(qiáng)，等.林木體胚發(fā)生技術(shù)進(jìn)展[J].林業(yè)科技開發(fā)，2000，14（3）：9-11.

[48] GUPTA P K， PULLMAN G S. Method for reproducing coniferous plants by somatic embryogenesis using adscisic acid and somotic potential varition：US，5036007 A[P].1991-07-30.

[49] VERHAGEN S A， WANN S R. Norway spruce somatic embryogenesis：High frequency initiation from light cultured mature embryos[J].Plant Cell Tiss Org Cult，1989，16：103.

[50] 韓繼成，馮志紅，陳霜瑩.梨離體葉片誘導(dǎo)不定芽的研究[J].河北果樹，1998，1（2）：12.

[51] 鄭均寶，田建強(qiáng)，蘇愛敏.741楊和蘋果試管苗玻璃化現(xiàn)象及其轉(zhuǎn)化研究[J].河北林學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，11（1）：6-12.

[52] LI C H，LIU B G，KIM T D，et al.Somatic embryogenesis and plant regeneration in elite genotypes of Picea koraiensis[J].Plant Biotechnol Rep，2008（2）：259-265.

[53] 孫志強(qiáng)，孫占育，席夢(mèng)利.針葉樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技開發(fā)，2010，24（4）：1-5.

[54] 靳小翠，楊模華，李志輝，等.馬尾松幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（4）：80-84.

[55] DRAGANA STOJICˇIC'，BRANKA UZELAC，DUICA JANOEVIC'.Induction of somatic embryogenesis in Pinus heldreichii culture[J].Arch Biol Sci，2007，59（3）：199-202.

[56] 何業(yè)華，方少秋，胡中沂，等.菠蘿體細(xì)胞胚發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（1）：57-63.

[57] 張宇.水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生的同步化調(diào)控[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2007.

[58] 劉慶昌，吳國(guó)良.植物細(xì)胞組織培養(yǎng)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.

[59] 張煥玲.栓皮櫟體胚成熟與萌發(fā)研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.

[60] 車建美，賴鐘雄.荔枝胚性愈傷組織早期體胚發(fā)生的同步化調(diào)控及其高頻率體胚發(fā)生[C]//陸維忠，鄭企成.全國(guó)作物細(xì)胞工程與分子技術(shù)育種學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2003：126-129.

[61] 方智振，賴鐘雄.龍眼體胚發(fā)生中期發(fā)育同步化的初步調(diào)控[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（1）：152-155.