食品和飼料中轉(zhuǎn)基因植物FMV35S啟動(dòng)子環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立

鄺筱珊 胡松楠 游淑珠等

摘要 [目的]建立FMV35S基因啟動(dòng)子環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的檢測(cè)方法。[方法]建立一種檢測(cè)食品和飼料中FMV35S轉(zhuǎn)基因成分的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法，并利用實(shí)時(shí)濁度法對(duì)該LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度、特異性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。[結(jié)果]該方法的檢測(cè)限為0.5%，特異性和穩(wěn)定性良好。采用LAMP法與熒光PCR方法進(jìn)行了實(shí)際樣品對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果一致可靠。[結(jié)論]可采用LAMP法對(duì)食品和飼料中FMV35S轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 食品；飼料；FMV35S基因；環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增；檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-04999-03

截止到2012年，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積已經(jīng)連續(xù)增長(zhǎng)17年，達(dá)到了420 000 000 hm2[1]。新型轉(zhuǎn)基因生物不斷涌現(xiàn)的同時(shí)，有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物在食品安全性、環(huán)境保護(hù)和倫理方面的爭(zhēng)論一直愈演愈烈。為了滿(mǎn)足消費(fèi)者的知情權(quán)和國(guó)際貿(mào)易的要求，越來(lái)越多的國(guó)家和地區(qū)要求對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)示。不同的國(guó)家和地區(qū)也相應(yīng)的發(fā)布了檢測(cè)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)也于2002年7月開(kāi)始實(shí)施《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理?xiàng)l例》，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理。

熒光PCR法是經(jīng)典的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，同時(shí)也是目前采用較多的一種檢測(cè)方法。近年來(lái)，越來(lái)越多的人將目光投向了非PCR檢測(cè)方法的研究，比如基于蛋白質(zhì)的ELISA、免疫層析試紙條方法；還有基于核酸的熒光交叉相關(guān)光譜法[2]、基于生物條形碼的電化學(xué)發(fā)光法[3]、基因芯片法[4]等。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一種新的、非PCR的核酸檢測(cè)方法[5]，最少可利用4條引物，在Bst DNA poLymerase作用下檢測(cè)目的基因片段。LAMP反應(yīng)有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：不需要復(fù)雜的儀器裝置，僅靠水浴鍋或等溫孵育裝置即可達(dá)到反應(yīng)要求；擴(kuò)增產(chǎn)物肉眼可辨，不需要檢測(cè)裝置即可快速準(zhǔn)確的判斷；、LAMP檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間短，1 h內(nèi)可出具檢測(cè)結(jié)果。基于以上優(yōu)點(diǎn)，近些年LAMP已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒、食源性微生物、轉(zhuǎn)基因和肉類(lèi)鑒定方面[6-10]。

玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子（Figwort Mosaic Virus promoter）FMV35S基因是植物遺傳操作常用標(biāo)記基因，很多轉(zhuǎn)基因植物（如MON89034，RT73等）都含有FMV35S基因，是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的重要指標(biāo)。筆者建立一種檢測(cè)食品和飼料中FMV35S轉(zhuǎn)基因成分的LAMP方法，為轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)擴(kuò)增提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。豇豆、四季豆、大豆、玉米、花生、白云豆、豌豆、燕麥、蕎麥、馬鈴薯、扁豆、番茄、核桃、大杏仁、綠豆、蠶豆、轉(zhuǎn)基因油菜RT73、轉(zhuǎn)基因水稻KMD、轉(zhuǎn)基因小麥B73.6.1、轉(zhuǎn)基因大豆DP305423、轉(zhuǎn)基因大豆A5547.127、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40.3.2、轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、轉(zhuǎn)基因玉米EVENT98140、轉(zhuǎn)基因玉米BT176和轉(zhuǎn)基因玉米MON810，均由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要儀器。PICO17高速臺(tái)式離心機(jī)，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；LA.320CLAMP實(shí)時(shí)濁度儀，購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社。

1.1.3 主要試劑。Bst DNA 聚合酶，購(gòu)自New England Biolabs（NEB）公司；甜菜堿（Betaine）和MgCl2，購(gòu)自Sigma公司；dNTPs，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；SYBR Green I 熒光染料，購(gòu)自廈門(mén)致善生物科技有限公司；LAMP引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取。將樣品置于粉碎機(jī)中均質(zhì)碾磨成粉末狀，植物樣品基因組DNA提取采用CTAB法[11]。DNA提取完畢后，利用Thermo Fisher Nanodorp 測(cè)定核酸含量和質(zhì)量。當(dāng)OD260/OD280比值在1.7～1.9時(shí)，濃度50～100 ng/μl適宜于LAMP檢測(cè)。

1.2.2 LAMP檢測(cè)體系和反應(yīng)條件。LAMP反應(yīng)體系總體積為25 μl，其成分包括：FIP和BIP各1.6 μmol/L，F(xiàn)3和B3各0.2 μmol/L，20 mmol/L Tris.HCl（pH8.8），10 mmol/L KCl，8 mmol/L MgSO4，10 mmol/L （NH4）2SO4，0.1% Tween20，1 mol/L甜菜堿，1.6 mmol/L dNTP，8 U Bst大片斷DNA聚合酶，2 μl DNA（50～100 ng/μl）。參照LAMP濁度儀使用說(shuō)明，將混合物置于反應(yīng)孔中，于63 ℃恒溫反應(yīng)60 min，最后于80 ℃下保溫5 min以結(jié)束反應(yīng)。

1.2.3 LAMP檢測(cè)法檢測(cè)FMV35S基因引物序列。通過(guò)GENEBANK下載FMV35S啟動(dòng)子序列，使用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 4 （http：//primerexplorer.jp/e）和LAMP Designer軟件設(shè)計(jì)特異引物FMV.4。

1.2.4 FMV35S基因LAMP檢測(cè)法靈敏度試驗(yàn)。用均質(zhì)的100%轉(zhuǎn)基因玉米MON89034粉與均質(zhì)非轉(zhuǎn)基因大豆粉按比例配置成20%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%（W/W）的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)稀釋度分別提取基因組DNA進(jìn)行LAMP試驗(yàn)，以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照，以FMV.4作為L(zhǎng)AMP引物，100%轉(zhuǎn)基因玉米MON89034作為陽(yáng)性對(duì)照，63 ℃運(yùn)行60 min以確定LAMP反應(yīng)的靈敏度。

1.2.5 FMV35S基因LAMP檢測(cè)法特異性試驗(yàn)。用轉(zhuǎn)基因油菜RT73、豇豆、四季豆、大豆、玉米、花生、白云豆、豌豆、燕麥、蕎麥、馬鈴薯、扁豆、番茄、核桃、大杏仁、綠豆、蠶豆、轉(zhuǎn)基因水稻KMD、轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1轉(zhuǎn)基因大豆DP305423、A5547-127、GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、MIR604、EVENT98140、BT176、MON810的DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，用FMV-4作為L(zhǎng)AMP引物進(jìn)行反應(yīng)，63 ℃反應(yīng)60 min，驗(yàn)證LAMP反應(yīng)的特異性，利用LAMP濁度儀觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.2.6 FMV35S基因LAMP檢測(cè)法穩(wěn)定性試驗(yàn)。利用建立的LAMP檢測(cè)法，分別對(duì)3個(gè)不同濃度（空白樣品0%和添加水平0.5%、1%的MON89034陽(yáng)性模擬樣品）及MON89034標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)20次，驗(yàn)證LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)管加入SYBR Green I觀察顏色變化，沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的陰性管呈橙色，有擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性管為綠色。利用LAMP濁度儀和肉眼直接觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.2.7 FMV35S基因LAMP檢測(cè)法的應(yīng)用。采用試驗(yàn)方法對(duì)市售的食品和飼料等20份樣進(jìn)行LAMP 檢測(cè)。采用熒光 PCR法驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果，熒光 PCR 檢測(cè)所用引物探針參考檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1204-2003。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMV35S基因LAMP檢測(cè)法的特異性評(píng)價(jià) 以27種不同植物DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，用試驗(yàn)設(shè)計(jì)的FMV.4引物作為L(zhǎng)AMP引物，進(jìn)行LAMP檢測(cè)。圖1表明，F(xiàn)MV.4引物只對(duì)含有FMV35S啟動(dòng)子的模板（MON89034，轉(zhuǎn)基因油菜RT73）特異性檢出，對(duì)其他不含F(xiàn)MV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因品系和非轉(zhuǎn)基因物種均無(wú)擴(kuò)增，未出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，表現(xiàn)出良好的特異性。

2.2 LAMP靈敏度測(cè)定 圖2表明，LAMP實(shí)時(shí)濁度法結(jié)果顯示，不同濃度陽(yáng)性模擬樣品的出峰時(shí)間和樣品濃度呈明顯梯度變化，LAMP實(shí)時(shí)濁度法檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.5%。最低檢出限0.5%出峰時(shí)間約41 min，可以將反應(yīng)時(shí)間確定為60 min。

2.3 LAMP穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 采用以FMV4為引物，對(duì)3種不同濃度樣品進(jìn)行LAMP檢測(cè)，每種樣品重復(fù)20次。由表2可知，1%、0.5%及陰性樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致，顯示該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.4 應(yīng)用LAMP法檢測(cè)食品中FMV35S轉(zhuǎn)基因成分 對(duì)市售燕麥片、小麥粉玉米球和菜籽粕20份食品和飼料樣品分別采用LAMP顯色法和實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。由表3可知，2種方法檢測(cè)結(jié)果一致，表明可以采用LAMP法檢測(cè)食品和飼料中FMV35S轉(zhuǎn)基因成分。

3 結(jié)論與討論

生物技術(shù)的不斷發(fā)展使新轉(zhuǎn)基因植物的種類(lèi)在不斷增加。圍繞轉(zhuǎn)基因植物的爭(zhēng)議也是層出不窮。建立簡(jiǎn)單、快速，成本低廉的檢測(cè)方法能夠更好保證相關(guān)貿(mào)易的順利進(jìn)行，也可以更加高效的阻止非法轉(zhuǎn)基因植物流入我國(guó)。 注：1為轉(zhuǎn)基因玉米MON89034，2為四季豆，3為大豆，4為玉米，5為花生，6為白云豆，7為豌豆，8為燕麥，9為蕎麥，10為馬鈴薯，11為扁豆，12為番茄，13為核桃，14為大杏仁，15為綠豆，16為蠶豆，17為轉(zhuǎn)基因水稻KMD，18為轉(zhuǎn)基因大豆DP305423，19為基因大豆DP305423，20為轉(zhuǎn)基因油菜RT73，21為轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2，22為豇豆，23為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604，24為轉(zhuǎn)基因玉米EVENT98140，25為轉(zhuǎn)基因玉米BT176，26為轉(zhuǎn)基因玉米MON810，27為轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127，28為H2O。自從PCR于1985年發(fā)明以來(lái)，有關(guān)核酸（DNA）的檢測(cè)多采用PCR法。目前檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分的主要方法是熒光PCR法。然而，需要昂貴的熒光PCR儀也是熒光PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分的缺點(diǎn)[12]。近幾年，盡管有很多非PCR方法檢測(cè)目的基因的方法被報(bào)道。但是，能夠達(dá)到與PCR法相同檢測(cè)限的方法很少[3]。該方法檢測(cè)限為0.5%，能夠滿(mǎn)足日常檢測(cè)的限量要求（歐盟和英國(guó)0.9%，巴西4%，澳大利亞和新西蘭1%，俄羅斯、中國(guó)香港、日本、中國(guó)臺(tái)灣5%，韓國(guó)和馬來(lái)西亞3%）。

已經(jīng)有報(bào)道采用LAMP法檢測(cè)不同品系的轉(zhuǎn)基因植物如轉(zhuǎn)基因大米BT63，KMD和KF6[13]，轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2[14]，轉(zhuǎn)基因玉米Bt176[15]。但是，對(duì)于含有多種原料的食品（餅干、面包、），很難逐一品系進(jìn)行檢測(cè)。這時(shí)篩選檢測(cè)則是較好的選擇。轉(zhuǎn)基因篩選檢測(cè)常用的目的基因包括：CaMV35S、NOS、NPTII和FMV35S等。FMV35S基因是植物遺傳操作常用標(biāo)記基因，可以作為一個(gè)重要的指標(biāo)判定食品和飼料中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。

試驗(yàn)建立了一種檢測(cè)食品和飼料中FMV35S轉(zhuǎn)基因成分的LAMP方法。與經(jīng)典PCR法相比，LAMP法更加快速、易操作，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)，不需要復(fù)雜的檢測(cè)儀器。該方法的檢測(cè)限為0.5%，特異性和穩(wěn)定性滿(mǎn)足日常檢測(cè)要求，對(duì)食品和飼料中日常的快速篩檢轉(zhuǎn)基因成分有重要的意義。

食品和飼料中轉(zhuǎn)基因植物FMV35S啟動(dòng)子環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立參考文獻(xiàn)

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責(zé)任編輯 李占東 責(zé)任校對(duì) 況玲玲