超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定香精香料中的香豆素和黃樟素

黃善松　范忠　黃世杰等

摘要 [目的]準(zhǔn)確快速地測定香精香料中的香豆素和黃樟素。[方法]以60%乙醇水溶液為溶劑，樣品經(jīng)振蕩萃取后，提取液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLCMS/MS）測定香豆素和黃樟素。[結(jié)果]該方法回收率的結(jié)果在95.0%～99.4%，日內(nèi)、日間測定結(jié)果的變異系數(shù)分別小于6%和8%，香豆素和黃樟素的定量限分別為77.0和68.1 μg /kg。[結(jié)論]該方法可有效去除雜質(zhì)干擾，分析時間短，具有高靈敏度、高精密度、高準(zhǔn)確度等優(yōu)點，適用于香精香料中的香豆素和黃樟素的測定。

關(guān)鍵詞 香豆素；黃樟素；香精香料；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法

中圖分類號 S609.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）20-06805-02

UPLCMS/MS Determination of Safrole and Coumarin in Flavor

HUANG Shansong， FAN Zhong et al （Technical Center of China Tobacco Guangxi Industrial Co.， Ltd.， Nanning， Guangxi 530001）

Abstract [Objective] The research aimed to obtain accurate and rapid determination of Safrole and Coumarin in flavor.[Method] With 60% ethanol water solution as solvent， the sample was extracted and oscillated， the solvent was filtered with 0.22 μm filter membrane.Safrole and Coumarin was determined by UPLCMS/MS，. [Result] The limit of quantifications of Safrole and Coumarin were 77.0 and 68.1 μg /kg， respectively.The intraday and interday precision was less than 6% and 8%， respectively.The recoveries of the spiked sample wre 95.0% to 99.4%. [Conclusion] The method effectively removed impurities and reduced extremely the preprocessor time.It was concluded that the method had high recovery， high sensitivity and good reproducibility.The developed analytical method had been applied successfully to the determination of Safrole and Coumarin in flavor.

Key words Safrole； Coumarin； Flavor； UPLCMS/MS

基金項目 廣西區(qū)科技廳科技攻關(guān)項目（桂科攻11194006）。

作者簡介 黃善松（1971- ），男，廣西桂林人，工程師，從事卷煙產(chǎn)品方面的研究。*通訊作者，從事煙草化學(xué)研究。

收稿日期 20140610

美國食品和藥品管理局（FDA）早在1954年就禁止在食品中添加香豆素，英國食品標(biāo)準(zhǔn)化委員會也于1965年就將香豆素列為禁止在食品中使用的添加劑，我國也禁止將其作為食品添加劑[1]。黃樟素主要來源于植物精油，曾用作飲料和食品中香料[2]。黃樟素能在肝組織中形成黃樟素-脫氧核糖核酸（DNA）加合物，食物中黃樟素的含量在0.5%以上時引起肝細(xì)胞瘤，有致癌作用，是消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的強(qiáng)致癌物，世界各國均禁止使用[3]。在香精、香料生產(chǎn)過程中有可能由天然植物精油帶入黃樟素、香豆素等成分，因此對香精香料中香豆素和黃樟素進(jìn)行測定和質(zhì)量控制是非常必要的。

目前，香豆素和黃樟素的測定方法主要有氣相色譜[4]、液相色譜[5-6]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法具有更好的分離度和選擇性、更高的靈敏度和更快的分析速度。但目前采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定香精香料中黃樟素和香豆素的方法未見報道。因此，筆者采用超高效液相色譜分離，電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量，建立了靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UPLCMS/MS）的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料 主要儀器：Agilent 1290 超高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；API 3200三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國AB公司；多功能全自動振蕩儀；分析天平（感量0.1 mg）。

主要試劑：

香豆素、香豆素d4，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥98%；黃樟素購自迪馬公司，純度≥97%；乙腈為色譜純，水為去離子子水，其他試劑均為分析純。

1.2 供試溶液的制備 稱取香豆素0.01 g，黃樟素0.01 g，精確至0.000 1 g，以60%乙醇水溶液定容至500 ml，再通過稀釋配含黃樟素和香豆素分別為5 μg/ml；稱取一定量香豆素d4，用60%乙醇水溶液配制濃度為125 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 樣品前處理

稱取約0.3 g（精度0.001 g）香精香料于50 ml三角瓶中，加入40 μl內(nèi)標(biāo)溶液，然后用移液管移取10 ml 60%乙醇水溶液，振蕩萃取10 min，轉(zhuǎn)速150 r/min，取上層清液，經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾后，供UPLCMS/MS測定。

1.4 分析條件

色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX StableBond SBC18色譜柱 （100 mm×2.1 mm， 粒徑1.8 μm）；進(jìn)樣量5 μl；柱溫為40 ℃；流動相為0.2%甲酸溶液-乙腈（體積比40∶60），等梯度洗脫；流速為0.25 ml/min，總分析時間為5 min。

質(zhì)譜條件： 質(zhì)譜檢測采用ESI 離子源，在正離子檢測方式下，選擇MRM工作模式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，優(yōu)化后的主要質(zhì)譜條件為：霧化氣

3.45×105Pa，輔助加熱氣3.45×105Pa，氣簾氣6.89×104Pa，電噴霧電壓5 000 V，干燥溫度600 ℃。具體化合物的MRM分析參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在正離子模式下以流動注射的方式先對1 mg/L香豆素等目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其母離子，然后分別以其分子離子選擇其子離子（碎片），每種物質(zhì)先選擇2個碎片，再從中選取信號較強(qiáng)、又無互相干擾的碎片定性和定量參數(shù)（表1）。

2.2 色譜條件及色譜柱的選擇

在流動相中加入0.2%甲酸水溶液有助于香豆素等目標(biāo)化合物[M+H]+母離子的形成，并能增強(qiáng)檢測的靈敏度。

為選擇適宜的色譜柱，對3種類型的色譜柱：ZORBAX StableBond SBC18 柱、ZORBAX Eclipse Plus C18柱和 Waters Symmetry C18柱的分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，ZORBAX StableBond SBC18 柱可以實現(xiàn)香豆素和黃樟素的良好分離，且峰形好，分析時間短（圖1）。

2.3 提取液的考察

該試驗考察了不同體積比甲醇水溶液、不同體積比乙醇水溶液作為提取溶劑的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60%乙醇水溶液的提取效果較好，回收率高，還可降低樣品中有機(jī)雜質(zhì)進(jìn)入色譜柱中的量，減少基質(zhì)效應(yīng)，并有效保護(hù)色譜柱。因此，該方法選擇60%乙醇水溶液作為提取液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢測限

取混合儲備液0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 ml，各加入內(nèi)標(biāo)溶液40 μl，用60%乙醇水溶液定容至10 ml，搖勻，得7級工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。對上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行UPLCMS/MS 分析，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值對二者相應(yīng)的濃度比值進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和相關(guān)系數(shù)（表2）。以3倍信噪比（S/N）為檢測限，10倍信噪比（S/N）為定量限，結(jié)果見表2。

2.5 精密度和回收率試驗

精密度試驗：取同一樣品進(jìn)行5次日內(nèi)和日間平行測定，考察了方法的精密度，得出該方法日內(nèi)、日間測定結(jié)果的變異系數(shù)分別小于6%和8%，說明該方法精密度高。

回收率試驗：在高（樣品中目標(biāo)物含量2倍）、中（樣品中目標(biāo)物含量1倍）、低（樣品中目標(biāo)物含量0.5倍）3個水平上進(jìn)行了樣品加標(biāo)回收率的測定。結(jié)果表明，回收率的結(jié)果在95.0%～99.4%，回收率良好。

2.6 實際樣品的測定

采用該方法對市場上的80多種香精香料樣品進(jìn)行香豆素和黃樟素的檢測，其中3個樣品中檢出香豆素（含量分別為137.1、456.0、25.1 mg/kg），1個樣品中檢出黃樟素（含量為141.5 μg/kg）。

3 結(jié)論

該試驗建立了快速準(zhǔn)確測定香精香料中的香豆素和黃樟素的UPLCMS/MS測定方法。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，日