國(guó)蘭雜交品種（系）SRAP—PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物快速篩選

龔理 黃添毅 王芳等

摘 要 以國(guó)蘭雜交品種（系）為材料，采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板及引物等5個(gè)重要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，確定國(guó)蘭雜交品種（系）SRAP-PCR反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)體系為（25 μL體系）：Taq DNA聚合酶，1 U；Mg2+，1.8 mmol/L；dNTPs，0.08 mmol/L；模板DNA，100 ng；引物，上下游各0.3 mmol/L；10×PCR Buffer，2.5 μL。此外，本試驗(yàn)采用DNA混合池技術(shù)（DNA pooling）快速篩選SRAP引物，從180對(duì)SRAP引物組合中篩選出39對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物豐富、多態(tài)性高的引物組合。與常規(guī)方法相比，該技術(shù)明顯縮短試驗(yàn)周期、節(jié)約了模板用量，為快速高效篩選SRAP引物提供了新思路。

關(guān)鍵詞 SRAP-PCR；體系優(yōu)化；DNA混合池；引物篩選

中圖分類(lèi)號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

中國(guó)蘭花又稱(chēng)國(guó)蘭，一般是指蘭屬（Cymbidium）地生蘭種類(lèi)中具有較高觀賞價(jià)值的一些種類(lèi)， 包括春蘭（C. goeringii）、蕙蘭（C. faberi）、建蘭（C. ensifolium）、墨蘭（C. sinense）、寒蘭（C. kanran）、蓮瓣蘭（C. tortisepalum）和春劍（C. tongibracteatum）7個(gè)種[1]。近年國(guó)蘭種內(nèi)及種間雜交已得到很大程度上的發(fā)展[2]。目前，國(guó)蘭雜交品種（系）的研究較少，父母本多不明確，對(duì)品種分類(lèi)及新品種選育帶來(lái)諸多不便。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是2001年Li和Quiros開(kāi)發(fā)的一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)[3]，其引物設(shè)計(jì)獨(dú)特，經(jīng)PCR擴(kuò)增，因不同個(gè)體內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性，具有操作簡(jiǎn)便、快速，多態(tài)性豐富，重復(fù)性好以及不需預(yù)知物種序列信息等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多態(tài)性研究[4]、品種鑒定[5]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[6]、測(cè)序以及基因克隆[7]等方面研究。利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)多種蘭科植物進(jìn)行分子鑒別、遺傳多樣性分析等方面研究也有相關(guān)報(bào)道[8-14]，但用于國(guó)蘭雜交品種（系）研究罕有報(bào)道。通過(guò)SRAP分子標(biāo)記分析，有助于已有國(guó)蘭雜交品種（系）資的整理分類(lèi)，鑒定親本來(lái)源，對(duì)新品種選育有重要的指導(dǎo)意義。因此，本研究對(duì)國(guó)蘭雜交品種（系）進(jìn)行SRAP-PCR體系優(yōu)化，為后期研究打下基礎(chǔ)。

本研究擬采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板及引物進(jìn)行5因素4水平優(yōu)化，建立國(guó)蘭雜交品種（系）SRAP-PCR反應(yīng)最優(yōu)反應(yīng)體系，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。常規(guī)引物篩選工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)。目前，DNA混合池技術(shù)在醫(yī)學(xué)上有著廣泛應(yīng)用[15-16]，在植物分子標(biāo)記引物篩選的應(yīng)用比較少[17]，在SRAP分子標(biāo)記引物篩選的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬采用DNA混合池（DNA pooling）技術(shù)快速篩選SRAP引物，為SRAP引物快速高效篩選尋求新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

國(guó)蘭雜交品種（系）樣品均取自福建省連城蘭花有限公司，取溫室內(nèi)一年生嫩葉3到4片放于裝有變色硅膠的自封袋中， 移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、DL 2000 Marker、6×loading buffer均購(gòu)自大連寶生物有限公司（Takara）。SRAP引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè) 國(guó)蘭雜交品種（系）基因組DNA的提取參照CTAB法[18]并進(jìn)行改良。用1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳儀為Bio-RAD Powerpac Basic，用Bio-RAD GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度與純度，并用1×TE緩沖液將其稀釋為50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 常規(guī)SRAP引物篩選與快速篩選的對(duì)比分析

分別將C1、C2、C3和C4、C5、C6 6個(gè)國(guó)蘭雜交品種（系）的基因組DNA等量混合，構(gòu)建2個(gè)基因組DNA混合池。隨機(jī)選取3對(duì)引物組合Me7/Em2、Me8/Em3、Me7/Em13，利用優(yōu)化的體系分別對(duì)6個(gè)國(guó)蘭雜交品種（系）及2個(gè)基因組DNA混合池進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5 DNA混合池引物快速篩選及驗(yàn)證 分別將C1、C2、C3，C4、C5、C6和C7、C8、C9 3組國(guó)蘭雜交品種（系）的基因組DNA等量混合，構(gòu)建3個(gè)基因組DNA混合池。為了提高混合池的篩選效應(yīng)，各組中均選擇在形態(tài)學(xué)性狀上有較大差異的品種（系）。分別用這3個(gè)DNA混合池對(duì)180對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，擴(kuò)增體系采用已優(yōu)化體系。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳染色后，選擇擴(kuò)增結(jié)果條帶數(shù)量多，帶型清晰的，多態(tài)性強(qiáng)的引物組合。

從所選引物中，隨機(jī)選擇一個(gè)引物組合對(duì)16個(gè)不同的國(guó)蘭雜交品種（系）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)引物篩選結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè)

2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化

經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表的16個(gè)組合均能擴(kuò)增出條帶（圖2）。但Taq DNA聚合酶濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度和模板DNA濃度5種影響因子對(duì)擴(kuò)增效果存在著明顯影響。依據(jù)譜帶的多態(tài)性、穩(wěn)定性及強(qiáng)弱對(duì) PCR 擴(kuò)增結(jié)果依次打分[20]，條帶數(shù)多、清晰、穩(wěn)定的最佳產(chǎn)物計(jì)16分，最差的計(jì)1分，3次重復(fù)獨(dú)立計(jì)分。

根據(jù)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)，用DPS軟件計(jì)算各因素同一水平下試驗(yàn)值之和（Ki）及該水平的數(shù)據(jù)平均值（ki），同一因素的最大平均值減去最小平均值得極差R。極差R的大小反映了不同因素對(duì)反應(yīng)體系的影響，R越大說(shuō)明該因素對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響越大。由表4中R值可得，對(duì)國(guó)蘭雜交品種（系）SRAP 反應(yīng)體系的影響大小順序依次為：Mg2+>引物> dNTPs>Taq DNA聚合酶>模板。在本試驗(yàn)中，正交表內(nèi)Mg2+濃度最高的4組均出現(xiàn)了條帶減少的現(xiàn)象，這可能是Mg2+與dNTPs結(jié)合，降低了dNTPs濃度所致。

每個(gè)因素水平下的數(shù)據(jù)平均值ki反映了該因素各水平對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，當(dāng)ki值最大時(shí)的濃度水平為最佳反應(yīng)體系。由表3可知，SRAP-PCR反應(yīng)中5個(gè)影響因素的最佳水平為：Taq DNA聚合酶（5 U/μL），0.2 μL；Mg2+（15 mmol/L），3.0 μL；dNTPs（10 mmol/L），0.2 μL；模板DNA（50 ng/μL），1 μL；引物（10 mmol/L），上下游引物各0.75 μL。在所設(shè)計(jì)的正交表中，組合6與之接近，僅模板DNA濃度不一致。由R值可知，模板DNA濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響最小，但低濃度可能會(huì)導(dǎo)致條帶不夠清晰，高濃度浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)材料，本研究初步擬定100 ng/μL為最優(yōu)模板DNA濃度。因此，本試驗(yàn)SRAP-PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系（25 μL）確定為：Taq DNA聚合酶（5 U/μL），0.2 μL；Mg2+（15 mmol/L），3.0 μL；dNTPs（10 mmol/L），0.2 μL；模板DNA（50 ng/μL），2 μL；引物（10 mmol/L），上下游引物各0.75 μL，用高壓雙蒸水補(bǔ)足25 μL。

2.3 常規(guī)SRAP引物篩選與快速篩選的對(duì)比分析

DNA混合池能較好地代表其組成成分單獨(dú)試驗(yàn)的結(jié)果。使用DNA混合池篩選引物，只需1次試驗(yàn)，便得到與多個(gè)單一樣品DNA進(jìn)行多次試驗(yàn)相同的效果，大大能減少試驗(yàn)次數(shù)，節(jié)約模板DNA用量，可達(dá)到快速篩選的目的。同時(shí)，在試驗(yàn)中常規(guī)引物篩與使用DNA混合池進(jìn)行引物快速篩選的擴(kuò)增效果基本一致，如引物Me7/Em2和Me7/Em13所擴(kuò)增的4組；引物Me8/Em3的擴(kuò)增結(jié)果中，常規(guī)引物篩選所得條帶多態(tài)性較少，同樣DNA混合池快速篩選的擴(kuò)增效果也不理想。以上結(jié)果表明，可利用DNA混合池技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速有效篩選SRAP引物的目的。

2.4 DNA混合池引物快速篩選及驗(yàn)證

3 討論與結(jié)論

蘭科植物多為珍稀瀕危植物，全世界所有野生蘭科植物均被列入《野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約》的保護(hù)范圍[21]。國(guó)蘭現(xiàn)有資源比較豐富，除幾個(gè)傳統(tǒng)國(guó)蘭種類(lèi)，春蘭、蕙蘭、建蘭、墨蘭和寒蘭的優(yōu)良品種間都可以進(jìn)行交配[22]，因此，國(guó)蘭人工新品種培育的道路比較寬廣，種內(nèi)種間雜交育種可能成為國(guó)蘭選育新品種的新方向。前人比較了RAPD、SSR、ISSR和SRAP等4種分子標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SRAP分子標(biāo)記的多態(tài)性及區(qū)分能力最強(qiáng)[23]。

目前，已有不少關(guān)于SRAP-PCR 反應(yīng)體系建立與優(yōu)化的報(bào)道，多數(shù)研究采用單因素多水平分析法[24-26]。單因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以直觀地了解各因素對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)的影響，但不能正確分析各因素間的相互作用。在PCR反應(yīng)體系中，各個(gè)因素都會(huì)影響SRAP-PCR的擴(kuò)增結(jié)果，而且各個(gè)因素之間往往存在相互影響。正交設(shè)計(jì)是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理研究各因素不同水平交互作用的一種試驗(yàn)方法[27]，用正交設(shè)計(jì)法安排試驗(yàn)，具有均衡分散和整齊可比的特點(diǎn)，可以通過(guò)部分試驗(yàn)了解試驗(yàn)的全面情況，較快地找到最佳組合。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化SRAP-PCR反應(yīng)體系，得出較優(yōu)的反應(yīng)體系，試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證利用此反應(yīng)體系的優(yōu)良性，使試驗(yàn)更科學(xué)簡(jiǎn)便。

SRAP分子標(biāo)記的引物是通用引物，引物篩選的結(jié)果直接影響下一步分析研究。目前，SRAP引物篩選部分采用單一樣品DNA進(jìn)行[28]。單次樣品DNA篩選的引物代表性不高，尤其不適用于基因組差異較大的種間雜交品種的引物篩選。更多研究SRAP引物篩選是選用多個(gè)樣品DNA進(jìn)行多次篩選[29-30]，選用多個(gè)差異相對(duì)較大的樣品DNA進(jìn)行引物篩選，可以篩選出更加可靠的引物組合，但為保證有效性，其篩選工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)。DNA混合池技術(shù)是把多個(gè)樣本的DNA溶液混在一起，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)組成混合池的樣本數(shù)量沒(méi)有固定要求，少到幾個(gè)，多到幾千都可以組成DNA混合池，它是一種切實(shí)有效，可以顯著降低相關(guān)試驗(yàn)成本的技術(shù)手段[31]。

本研究首次使用DNA混合池技術(shù)進(jìn)行國(guó)蘭雜交品種（系）SRAP分子標(biāo)記的引物篩選。從180對(duì)引物組合中，成功篩選出32對(duì)條帶清晰且具多態(tài)性的引物組合。使用DNA混合池技術(shù)，只需1次混合模板試驗(yàn)便可以得到3次單獨(dú)模板試驗(yàn)的效果，縮短了試驗(yàn)周期，節(jié)約了模板DNA的用量，同時(shí)提高了所選引物的可靠性。雖然DNA混合池對(duì)樣本的數(shù)量沒(méi)有要求[31]，然而DNA混合池的構(gòu)成對(duì)快速篩選SRAP引物有著重要的影響，為確保所選得SRAP引物有更廣的適用性，本試驗(yàn)的DNA混合池選用9個(gè)形態(tài)學(xué)性狀相關(guān)較大的國(guó)蘭雜交品種（系）DNA樣品，分成3組進(jìn)行等量混合，以保證各個(gè)樣品在混合池中的濃度和數(shù)量，使得構(gòu)建出來(lái)的3個(gè)DNA 混合池能夠同等的代表其中的3個(gè)樣品。電泳檢測(cè)所得條帶也充分顯示出構(gòu)建的DNA 混合池與3個(gè)樣品的濃度和片段大小都比較一致，可以作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選引物。為了保證DNA混合池中各成分的濃度，本試驗(yàn)僅將3個(gè)樣品混成混合池，至于更多樣品混合，是否有更高的引物篩選效果，還有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：古小玲