熱辣2號(hào)辣椒純度鑒定及優(yōu)良自交系遺傳多樣性分析

劉子記　楊衍　孫繼華等

摘 要 為了提高種子質(zhì)量和充分利用辣椒種質(zhì)資源，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記對(duì)熱辣2號(hào)雜交種純度進(jìn)行鑒定并對(duì)部分辣椒優(yōu)良自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析。以熱辣2號(hào)母本材料CAYB02和父本材料CAYB01為模板篩選85對(duì)辣椒SSR引物，其中12對(duì)引物在親本間能擴(kuò)增出明顯的多態(tài)性，多態(tài)性比率為14.12%，多態(tài)性標(biāo)記分別位于辣椒1、3、4、6、7、9、11、12號(hào)染色體，利用3對(duì)位于不同染色體上的SSR標(biāo)記對(duì)熱辣2號(hào)黃燈籠椒雜交種的純度進(jìn)行鑒定，熱辣2號(hào)種子純度為98.79%，標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致。研究結(jié)果表明，利用SSR標(biāo)記鑒定辣椒雜交種純度是切實(shí)可行的。利用12對(duì)多態(tài)性明顯、穩(wěn)定可靠的SSR引物對(duì)部分辣椒自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出60條條帶，多態(tài)性位點(diǎn)比率為100%，平均每對(duì)引物檢測(cè)出5個(gè)等位基因。30份辣椒自交系間遺傳相似系數(shù)變幅為0.33～1.00，平均為0.65，表明供試材料間具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.47時(shí)，可以將中國(guó)辣椒和一年生辣椒區(qū)分開來(lái)。在遺傳相似系數(shù)為0.85時(shí)，30份辣椒優(yōu)良自交系分為11個(gè)類群，辣椒種質(zhì)遺傳關(guān)系與地理來(lái)源和農(nóng)藝性狀具有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 熱辣2號(hào)；SSR；雜交種；純度鑒定；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號(hào) S641.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，開展雜交種純度檢測(cè)對(duì)保證種子質(zhì)量、提高生產(chǎn)效益與雜種優(yōu)勢(shì)的有效利用具有重要意義[1]。作物雜交種純度檢驗(yàn)的常用方法主要包括田間種植鑒定和同工酶電泳鑒定等[2]。田間種植鑒定主要基于成株期植株及果實(shí)的形態(tài)特征，需要耗費(fèi)大量的土地資源和勞動(dòng)力，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，并且易受環(huán)境條件的影響[3-4]。對(duì)于遺傳基礎(chǔ)比較狹窄的作物，真正的雜交種和假雜交種形態(tài)差異不一定總是很明顯，鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)受到影響。同工酶電泳鑒定具有組織器官特異性，受植株發(fā)育階段的影響，多態(tài)性水平較低[5-6]。傳統(tǒng)的鑒定方法難以滿足作物品種純度鑒定在精確度方面的要求。急需開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的雜交種純度檢測(cè)方法。分子標(biāo)記技術(shù)可以彌補(bǔ)雜交種純度傳統(tǒng)鑒定中的許多缺陷，為作物雜交種純度鑒定提供一種準(zhǔn)確、快速和簡(jiǎn)便的方法。Ballester等[7]和李成偉等[8]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)鑒定辣椒雜交種純度，結(jié)果證明RAPD技術(shù)可用于辣椒雜交種純度的快速鑒定。王得元等[9]和李智軍等[10]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分別檢測(cè)‘粵椒1號(hào)和黃皮尖椒‘秀黃F1種子純度，鑒定結(jié)果與田間檢測(cè)結(jié)果完全一致。

種質(zhì)資源是栽培品種改良、新品種選育的基礎(chǔ)。辣椒作為一種世界性蔬菜作物具有豐富的遺傳和表型多樣性，遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和利用的主要內(nèi)容之一。加強(qiáng)辣椒遺傳多樣性研究，篩選優(yōu)異種質(zhì)資源，對(duì)改良辣椒品種、提高辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。陳學(xué)軍等[11]利用RAPD、ISSR標(biāo)記及表型數(shù)據(jù)對(duì)13份辣椒材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明基于RAPD、ISSR的聚類結(jié)果與基于表型數(shù)據(jù)的聚類結(jié)果之間存在極顯著正相關(guān)，能夠?qū)⒁荒晟苯放c其它栽培種區(qū)分開來(lái)。李晴等[12]利用RAPD標(biāo)記分析了37份辣椒種質(zhì)遺傳多樣性，將37份辣椒種質(zhì)分為5個(gè)類群。

盡管RAPD標(biāo)記操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，不需要提前知道基因組序列信息，但RAPD標(biāo)記多為顯性標(biāo)記，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，易受各種因素影響，ISSR分子標(biāo)記大部分為顯性標(biāo)記，利用RAPD和ISSR標(biāo)記進(jìn)行種子純度鑒定和遺傳多樣性分析具有一定的局限性。SSR，即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，是一類由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標(biāo)記在真核生物基因組中具有數(shù)量豐富、分布均勻、共顯性遺傳、等位性變異豐富、操作簡(jiǎn)單、不受環(huán)境因素影響、穩(wěn)定性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行作物遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、雜交種純度鑒定、基因定位及標(biāo)記輔助育種的理想標(biāo)記類型[13]，已在多種農(nóng)作物雜交種純度鑒定中得到應(yīng)用[14-15]。但在辣椒雜交種純度鑒定及遺傳多樣性分析方面鮮有報(bào)道。本研究擬利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)熱辣2號(hào)黃燈籠椒雜交種進(jìn)行純度鑒定并對(duì)海南地區(qū)30份辣椒優(yōu)良自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為辣椒良種的及時(shí)銷售與種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒雜交種一代熱辣2號(hào)醬用型黃燈籠辣椒，母本材料CAYB02和父本材料CAYB01由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。熱辣2號(hào)醬用型黃燈籠辣椒是中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所經(jīng)多年研究選育出的雜種一代醬用型黃燈籠椒。播種至開花約需80 d，至大量收獲約需142 d，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，始收時(shí)株高55～60 cm，最高株高130 cm，最大開展度90 cm，分枝能力極強(qiáng)，葉淺綠色至綠色，每節(jié)花數(shù)為3～10朵，未成熟果深綠色，老熟果中黃色至深黃色，果長(zhǎng)5.5 cm左右，果寬3.5 cm左右，單果重14.5 g左右，最大單果重可達(dá)22 g，每果位座果1～3個(gè)，個(gè)別果位可座果4～6個(gè)，一般單株座果130個(gè)左右，每公頃產(chǎn)量45 000 kg左右，最高可達(dá)75 000 kg。

供試?yán)苯穬?yōu)良自交系共30份，均是經(jīng)過(guò)多次雜交、回交和自交選育出的自交系，抗逆性及部分農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良，并且適應(yīng)海南地區(qū)的氣候條件。其中中國(guó)辣椒22份，一年生辣椒8份。在22份中國(guó)辣椒種質(zhì)中，7份來(lái)自中國(guó)，6份來(lái)自英國(guó)，7份來(lái)自法國(guó)，1份來(lái)自美國(guó)，1份來(lái)自巴西。在8份一年生辣椒種質(zhì)中，7份來(lái)自中國(guó)，1份來(lái)自美國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 將供試的辣椒材料播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，按照常規(guī)栽培措施進(jìn)行管理，待植株生長(zhǎng)至4～5片真葉時(shí)取材提取葉片基因組DNA，提取方法采用Liu等[16]的CTAB法提取。

1.2.2 多態(tài)性標(biāo)記分析 選取來(lái)源地和農(nóng)藝性狀差異顯著的中國(guó)辣椒材料CAYB01、CAYB02和一年生辣椒CA269的基因組DNA為模板，利用已開發(fā)的辣椒SSR引物（http：//solgenomics.net/search/markers）進(jìn)行擴(kuò)增，篩選多態(tài)性的SSR標(biāo)記。

PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中包括10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），45 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，

0.2 mmol/L dNTPs，55 ng引物，0.5 U Taq DNA聚合酶，60～80 ng模板DNA。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，50～60 ℃（根據(jù)具體引物的退火溫度而定）退火35 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。PCR產(chǎn)物保存于4 ℃。5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混合經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺 ∶ 甲叉雙丙烯酰胺=39 ∶ 1）電泳，銀染顯色進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 熱辣2號(hào)種子純度鑒定 以熱辣2號(hào)黃燈籠椒單株DNA為模板，利用在親本材料間表現(xiàn)為共顯性的SSR標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)特異譜帶的有無(wú)檢測(cè)雜交種的純度。將取材后的辣椒幼苗按照順序移栽到土質(zhì)肥沃的地塊，采用常規(guī)措施進(jìn)行管理，在熱辣2號(hào)黃燈籠椒成株期依據(jù)品種特征特性逐株進(jìn)行鑒定，將標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將電泳圖譜上清晰條帶記為“1”，同一位置沒(méi)有條帶記為“0”，構(gòu)建[1， 0]二元數(shù)列矩陣，利用NTsys_2.10e軟件Qualitative data相似性分析模塊計(jì)算供試材料間的遺傳相似系數(shù)，采用SAHN聚類分析模塊中的UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱辣2號(hào)親本間多態(tài)性標(biāo)記篩選

以熱辣2號(hào)母本材料CAYB02和父本材料CAYB01為模板篩選85對(duì)辣椒SSR引物，其中12對(duì)引物在親本間能擴(kuò)增出明顯的多態(tài)性，多態(tài)性比率為14.12%，多態(tài)性標(biāo)記分別位于辣椒1、3、4、6、7、9、11、12號(hào)染色體，多態(tài)性片段大小100～300 bp。

2.2 熱辣2號(hào)雜交種純度鑒定

利用多態(tài)性的共顯性標(biāo)記SSR7、SSR58和SSR64對(duì)165株熱辣2號(hào)黃燈籠椒進(jìn)行純度鑒定，從SSR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果看出，163個(gè)熱辣2號(hào)單株既具有母本特異譜帶也具有父本特異譜帶，屬于真實(shí)的雜交種，5號(hào)和24號(hào)單株缺少父本特異帶，與母本擴(kuò)增帶型一致，說(shuō)明5號(hào)和24號(hào)單株為母本自交株，3對(duì)標(biāo)記的鑒定結(jié)果完全一致（圖1），熱辣2號(hào)雜交種的純度為98.79%。成株期田間調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5號(hào)和24號(hào)植株與母本性狀一樣，果皮顏色為淺綠色，其余植株均具有熱辣2號(hào)黃燈籠椒典型特征，果皮顏色為深綠色。田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與SSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果完全一致，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SSR技術(shù)可用于醬用型辣椒熱辣2號(hào)的種子純度快速檢測(cè)。

2.3 遺傳相似性分析

以中國(guó)辣椒材料CAYB01、CAYB02和一年生辣椒CA269的基因組DNA為模板篩選85對(duì)辣椒SSR引物，其中22對(duì)引物在三份材料間存在多態(tài)性，多態(tài)性比率為25.88%。選取12對(duì)擴(kuò)增條帶清晰，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好的SSR標(biāo)記，分別位于1、2、3、5、7、9、11、12號(hào)染色體上，對(duì)30份辣椒優(yōu)良自交系進(jìn)行多樣性分析。12對(duì)SSR標(biāo)記在辣椒優(yōu)良自交系中共擴(kuò)增出60條條帶，多態(tài)性比率為100%，多態(tài)性片段大小為100～360 bp（表3和圖2）。統(tǒng)計(jì)PCR擴(kuò)增條帶，按照條帶的有無(wú)分別記為1和0，構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，利用NTsys_2.10e軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，在供試的30份材料中，不同辣椒種質(zhì)間遺傳相似性系數(shù)變幅為0.33～1.00，平均為0.65，表明這些自交系間遺傳差異較大。其中一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8間，中國(guó)辣椒CA05和CA16間，中國(guó)辣椒CA15和CA09間相似性系數(shù)最大，為1.00，表明這些材料間親緣關(guān)系較近。中國(guó)辣椒CA12與一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8間相似性系數(shù)最小，為0.33，表明中國(guó)辣椒CA12與一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 聚類分析

基于辣椒種質(zhì)間相似系數(shù)矩陣，利用NTsys_2.10e軟件進(jìn)行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.47處可以將中國(guó)辣椒種質(zhì)資源與一年生辣椒種質(zhì)資源區(qū)分開。在遺傳相似系數(shù)為0.85處，30份辣椒優(yōu)良自交系資源被分為11個(gè)類群，第1類群包括11份中國(guó)辣椒種質(zhì)，分別為來(lái)自中國(guó)海南2份，來(lái)自法國(guó)7份，來(lái)自巴西1份，來(lái)自中國(guó)云南1份。第2類群包括5份來(lái)自英國(guó)的中國(guó)辣椒種質(zhì)。第3類群包括1份來(lái)自英國(guó)的中國(guó)辣椒種質(zhì)。第4類群包括1份來(lái)自美國(guó)的中國(guó)辣椒種質(zhì)。第5、6、7、8類群分別包含1份來(lái)自中國(guó)的中國(guó)辣椒種質(zhì)。第9類群包括5份來(lái)自中國(guó)的一年生辣椒種質(zhì)，其中CA202、CAF9、CAF1和CAM8屬于一年生辣椒中的燈籠椒，CA267屬于一年生辣椒中的短錐椒。第10類群包括2份來(lái)自中國(guó)的一年生辣椒種質(zhì)CA211和CA92，屬于一年生辣椒中的長(zhǎng)角椒。第11類群包括1份來(lái)自美國(guó)的一年生辣椒種質(zhì)CA269，屬于一年生辣椒中的櫻桃椒。同一來(lái)源地的材料和農(nóng)藝性狀相似的材料具有聚集在一起的趨勢(shì)，如來(lái)自中國(guó)海南的CAYB01和CA07，來(lái)自法國(guó)的CA05和CA16，CA04和CA17，CA15和CA09，來(lái)自英國(guó)的CAYB02、CA60、CA57、CA78和CA49，一年生燈籠椒CA202、CAF9、CAF1和CAM8，一年生長(zhǎng)角椒CA211和CA92。第3、4、5、6、7、8和11類群分別由1份種質(zhì)材料組成，表明這7份種質(zhì)與其余種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。本研究室選取親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的中國(guó)辣椒自交系配制了雜交組合，其中CAYB02×CAYB01、CA12×CA11、CAYB02×CA11、CA12×CA18的辣度分別為172 000、214 000、217 000和332 000 SHU，產(chǎn)量和綜合抗病能力均優(yōu)于本地對(duì)照品種。

3 討論與結(jié)論

辣椒在制種過(guò)程中大部分都是通過(guò)人工去雄完成的，所以影響辣椒雜交種子純度的主要問(wèn)題就是母本去雄不徹底形成的自交種。此外，制種過(guò)程中的串粉及收獲后的機(jī)械混雜也是導(dǎo)致雜株產(chǎn)生的原因。分子標(biāo)記技術(shù)因其準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、不受環(huán)境因素影響、無(wú)器官、組織及發(fā)育特異性等特點(diǎn)，已逐步成為作物雜交種純度檢測(cè)的主要工具[17]，近年來(lái)，RFLP、AFLP、RAPD和ISSR標(biāo)記被廣泛用于作物品種指紋圖譜構(gòu)建、種子純度鑒定和種質(zhì)資源鑒定[18-20]。但RFLP標(biāo)記價(jià)格昂貴、操作流程比較復(fù)雜并且?guī)в蟹派湫?；AFLP標(biāo)記對(duì)DNA的質(zhì)量要求很高，不適于進(jìn)行大批量雜交種純度鑒定；RAPD和ISSR標(biāo)記多為顯性標(biāo)記，不能將雜合體和純合體有效區(qū)分。SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，在植物基因組上均衡分布[21-22]，共顯性遺傳，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，目前是進(jìn)行作物雜交種純度鑒定最理想的標(biāo)記類型，被廣泛用于作物種子純度鑒定[23-25]。但在辣椒雜交種純度鑒定方面鮮有報(bào)道。本研究利用SSR標(biāo)記檢測(cè)熱辣2號(hào)黃燈籠椒雜交種純度，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果完全一致，熱辣2號(hào)雜交種純度為98.79%，熱辣2號(hào)黃燈籠椒雜交種中僅混雜了母本自交種，可能是由于去雄不徹底導(dǎo)致的母本自交種。該研究結(jié)果表明利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)熱辣2號(hào)雜交種純度是切實(shí)可行的。

Nandakumar等[26]和Yashitola等[17]研究提出單對(duì)多態(tài)性的SSR標(biāo)記可以充分地對(duì)雜交種純度進(jìn)行鑒定。然而，在品種選育過(guò)程中因親本自交代數(shù)不夠，存在親本本身遺傳背景未完全純合的現(xiàn)象，某些位點(diǎn)還處于雜合狀態(tài)，因此利用這些標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行純度檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確性較差。Sundaram等[27]利用多對(duì)SSR標(biāo)記基于多重PCR技術(shù)對(duì)水稻雜交種進(jìn)行純度檢測(cè)，進(jìn)一步證明了多對(duì)標(biāo)記檢測(cè)相對(duì)于單對(duì)標(biāo)記檢測(cè)在準(zhǔn)確性方面的優(yōu)勢(shì)?；谶@一觀點(diǎn)，為確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究選取3對(duì)位于辣椒不同染色體上的共顯性SSR標(biāo)記檢測(cè)熱辣2號(hào)黃燈籠椒雜交種純度，3對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果完全一致，并且分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果達(dá)到了完全一致，這也進(jìn)一步表明熱辣2號(hào)黃燈籠椒親本材料純合度較高。

作物種質(zhì)資源是實(shí)現(xiàn)各個(gè)育種途徑的原始材料，育種效果在很大程度上決定于原始材料的選擇。對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行研究有助于了解不同種質(zhì)的遺傳背景及品種間的親緣關(guān)系，可以有效地進(jìn)行親本選配，從而更加合理地進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[28]。本研究利用位于辣椒不同染色體上SSR標(biāo)記對(duì)30份辣椒優(yōu)良自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，遺傳相似性分析結(jié)果表明供試?yán)苯贩N質(zhì)間具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結(jié)果表明，SSR標(biāo)記可以把不同栽培種的辣椒材料區(qū)分開來(lái)，相同來(lái)源地的材料和農(nóng)藝性狀相似的材料具有聚集在一起的趨勢(shì)，如來(lái)自中國(guó)海南的CAYB01和CA07，來(lái)自法國(guó)的CA05和CA16，CA04和CA17，CA15和CA09，來(lái)自英國(guó)的CAYB02、CA60、CA57、CA78和CA49，一年生燈籠椒CA202、CAF9、CAF1和CAM8，一年生長(zhǎng)角椒CA211和CA92。CASM4、CA44、CA01和CA38雖都為來(lái)自中國(guó)的中國(guó)辣椒種質(zhì)，但卻單獨(dú)聚為一類，這可能是由于種質(zhì)資源的遺傳改良導(dǎo)致了遺傳背景的差異。第3、4、5、6、7、8和11類群分別由1份種質(zhì)材料組成，表明這7份種質(zhì)與其余種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。實(shí)踐中為了更好地利用雜種優(yōu)勢(shì)，可以選取親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)配制雜交組合。本研究室已經(jīng)根據(jù)中國(guó)辣椒自交系的親緣關(guān)系配制了雜交組合，其辣椒素的含量均顯著優(yōu)于對(duì)照品種。

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