高效液相色譜熒光檢測(cè)法檢測(cè)雞組織中氨芐西林殘留量

摘要 [目的] 為氨芐西林在雞組織中的殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。[方法] 建立檢測(cè)雞組織中氨芐西林殘留量的高效液相色譜熒光法。[結(jié)果] 氨芐西林在25～1 000 μg/kg 濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好。當(dāng)氨芐西林添加量為10.0～125.0 μg/ml時(shí)，雞組織中AMP的平均回收率為71.23%～88.86%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10.74%；檢測(cè)限和定量限分別為3.5（S/N=3）和10.0 μg/kg（S/N=10）。[結(jié)論] 該方法操作簡(jiǎn)便快速，可適用于雞組織中氨芐西林的提取和檢測(cè)，且準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜；氨芐西林；熒光檢測(cè)法

中圖分類號(hào) S851.34+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）20-06615-03

Determination of Residual Amount of Ampicillin in Chicken Tissues by HPLC with Fluorescence Detection

SUN Lirui， XIE Kaizhou et al

（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract [Objective] The research aimed to provide scientific basis for establishing the standards for detecting the residue of ampicillin （AMP） in chicken tissues. [Method] A high performance liquid chromatography with fluorescence detection （HPLCFLD） method was established for detecting the residual amount of ampicillin （AMP） in chicken tissues.[Result] The chromatographic peak area showed a good linear relationship with ampicillin concentration in the range of 25-1 000 μg/kg. When the addition amount of ampicillin was 10.0-125.0 μg/kg， the average recovery rate of AMP in chicken tissues was 71.23%-88.86%， with RSD of less than 10.74%. Limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 3.5 μg/kg （S/N=3）and 10 μg/kg（S/N=10）， respectively. [Conclusion] This HPLCFLD method was simple and rapid， and it was suitable for the extraction and determination of ampicillin in chicken tissues. And the accuracy and precession could meet the demands of residual analysis.

Key words HPLC； Ampicillin （AMP）； Fluorescence detection

氨芐西林（Ampicillin）又稱氨芐青霉素，是在天然青霉素結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造而來(lái)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的殺菌作用。與其他抗生素相比，氨芐西林具有抗菌譜廣、耐酸堿、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)。然而，氨芐西林在動(dòng)物體中利用率低，大部分以原體或者代謝物的形式從動(dòng)物體中排泄到環(huán)境中，進(jìn)而危害人類健康[1-2]。許多國(guó)家已經(jīng)對(duì)家禽組織中的氨芐西林最高殘留限量（MRLs）做出了規(guī)定[3-4]，規(guī)定雞組織中的MRLs不應(yīng)超過(guò)50 μg/kg。因此，研究雞組織中氨芐西林的殘留快速檢測(cè)方法具有重要的意義。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于雞組織中氨芐西林殘留檢測(cè)的方法雖已有報(bào)道[5-7]，但運(yùn)用高效液相熒光檢測(cè)法檢測(cè)雞組織中氨芐西林殘留的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者嘗試建立雞組織中氨芐西林檢測(cè)的高效液相色譜熒光檢測(cè)法，旨在為氨芐西林在雞組織中的殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品、主要試劑及其配制

氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%，德國(guó)Labor Dr. EhrenstorferSchaefers，批號(hào)為C10243080；氨芐西林原粉，純度97.62%（實(shí)測(cè)含量），購(gòu)自江蘇倍康藥業(yè)有限公司；乙腈，色譜純，購(gòu)自美國(guó)Sigma有限公司；磷酸二氫鉀，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水楊醛，分析純，購(gòu)自Aladdin Chemistry Co. Ltd；超純水，由ELGA公司超純水儀制備，電阻率為18.2 MΩ，符合國(guó)家試驗(yàn)室用水規(guī)格（GB 6682-1992）。

氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品10.10 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，用超純水溶解并定容，配制成 1.00 mg/ml的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-34 ℃下保存，可穩(wěn)定保存2個(gè)月。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（型號(hào)Waters515，配備2臺(tái)515型高壓泵、2475型熒光檢測(cè)器、柱溫箱和色譜工作站等，購(gòu)自美國(guó)Waters公司）；熒光分光光度計(jì)（型號(hào)日立F-4500，購(gòu)自日本日立公司）；紫外分光光度計(jì)（型號(hào)UV-2401，購(gòu)自日本島津公司）；高速冷凍離心機(jī)（5810R型，購(gòu)自德國(guó)Eppendof公司）；高速離心機(jī)（5804R型，購(gòu)自德國(guó)Eppendof公司）；超純水制備儀（Purelab Option，購(gòu)自英國(guó)ELGA公司）；恒溫磁力攪拌器（521-2型，購(gòu)自上海司樂(lè)儀器有限公司）；無(wú)油真空泵（AP-01型，購(gòu)自天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；組織勻漿機(jī)（型號(hào)ART MICCRA D-9，購(gòu)自德國(guó)ART-moderne Labortechnik e.k.公司）等。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物的分組及樣品采集

16周齡京海黃雞72只，公、母各半，隨機(jī)分成2組，分別為氨芐西林投藥組（54只）和空白對(duì)照組（18只）。試驗(yàn)雞均單籠飼養(yǎng)，給藥前分別稱重并編號(hào)。試驗(yàn)前預(yù)飼7 d，飼喂不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料（自制于江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司飼料廠），自由飲水。試驗(yàn)組雞按體質(zhì)量以120 mg/（kg·d）的劑量給藥。于停藥后4 h各試驗(yàn)組取6只雞進(jìn)行屠宰試驗(yàn)，分別取兩側(cè)胸肌肉、全肝和全腎，于-34 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1

樣品的提取與凈化。準(zhǔn)確稱取3.0 g剪碎后的雞肌肉（或肝臟或腎臟）組織，置于50 ml的具塞離心管中，添加0.01 mg/L的磷酸二氫鈉溶液（pH 4.5）3 ml，17 000 r/min勻漿30 s。添加8 ml乙腈沖洗勻漿刀頭并轉(zhuǎn)入勻漿液中，振蕩混勻，水浴超聲輔助萃取15 min。4 ℃下10 700×g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至另1個(gè)干凈離心管中。在殘?jiān)性偌尤? ml磷酸二氫鈉溶液重復(fù)提取1次，勻漿后再添加8 ml乙腈，振蕩混勻，超聲萃取10 min，合并上清液。添加5 ml用75%乙腈飽和的正己烷，振蕩混勻后靜置并去除上層溶液，重復(fù)去脂1次。添加15 ml超純水飽和的二氯甲烷溶液，振蕩，10 700×g離心5 min后，轉(zhuǎn)移上清液至10 ml玻璃管中。

1.4.2

樣品的衍生化。將玻璃管中收集的上清液超聲脫氣15 min，然后置于真空干燥器中濃縮至干。向玻璃離心管中加入超純水1 ml，然后分別加入20%的三氯乙酸溶液200 μl、甲醛20 μl，漩渦混勻20 s，100 ℃水浴加熱30 min。反應(yīng)后取出樣品，水浴冷卻，將樣品轉(zhuǎn)移到2 ml離心管中，并用磷酸二氫鉀/乙腈（V∶V=60∶40）混合溶液洗滌玻璃管2次，合并到2 ml離心管中，并定容至2 ml刻度。12 100×g離心15 min，取上清液供高效液相色譜分析。

1.4.3

色譜操作條件及參數(shù)。色譜柱：CNWAthenaC18WP柱，粒徑5 μm，4.6 mm ×250 mm i.d.；保護(hù)柱：C18柱，5 μm；流動(dòng)相-乙腈：KH2PO4溶液（0.01 mol/L，pH 5.5，V/V）；流速為1.0 ml/min；激發(fā)波長(zhǎng)327 nm，發(fā)射波長(zhǎng)409 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為200 μl。

1.4.4

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，依次用空白基質(zhì)提取液稀釋成濃度分別為25（0.5 MRL）、50（1 MRL）、100（2 MRL）、150（3 MRL）、250（5 MRL）、500（10 MRL）和1 000 μg/kg（20MRL）的標(biāo)準(zhǔn)工作液。各個(gè)濃度點(diǎn)準(zhǔn)確量取1 ml，按衍生化反應(yīng)步驟衍生，得到系列濃度的氨芐西林衍生產(chǎn)物，在選定的色譜條件下，按濃度從低到高的順序分別進(jìn)樣200 μl進(jìn)行HPLC分析，每個(gè)濃度重復(fù)4次，取平均值。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此曲線作為待測(cè)樣品的定量曲線，并求出其回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.5

回收率及精密度的測(cè)定。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，取剪碎的空白組織（雞肌肉、肝臟、腎臟）樣品，置于50 ml聚丙烯離心管中，添加適宜濃度的AMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，使組織樣品中藥物濃度分別為10、25、50和100 μg/kg，室溫下靜置30 min，作為空白添加試樣，每個(gè)濃度水平設(shè)置6個(gè)平行，經(jīng)“1.4.1”和“1.4.2”的方法處理后，供HPLC測(cè)定，外標(biāo)法定量，計(jì)算出回收率。將回收率檢測(cè)剩余的樣品按4個(gè)不同濃度合并成4份，得到4組不同藥物濃度的樣品。在同一天內(nèi)不同時(shí)間用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)高效液相色譜儀6次重復(fù)測(cè)定4組藥物濃度的樣品，計(jì)算日內(nèi)（批內(nèi)）精密度。在1周內(nèi)不同天用不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)高效液相色譜儀6次重復(fù)測(cè)定4組藥物濃度的樣品，計(jì)算日間（批間）精密度。

1.4.6

檢測(cè)限和定量限的測(cè)定。分別用空白肌肉、肝臟、腎臟按“1.4.1”中步驟制取空白基質(zhì)提取液，再分別向其添加一定濃度的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4.2”中步驟對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，取上清液進(jìn)行HPLC分析，以信噪比（S/N）為3和10分別作為藥物在雞組織中的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ），并計(jì)算LOQ濃度點(diǎn)的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），驗(yàn)證其可靠性[8]。

1.4.7

雞組織中氨芐西林的測(cè)定。按外標(biāo)法，將雞組織（肌肉、肝臟、腎臟）中所測(cè)定的氨芐西林色譜峰面積帶入基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到雞組織中氨芐西林的殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離

在優(yōu)化的色譜條件下，測(cè)得雞肌肉、肝臟、腎臟中AMP的保留時(shí)間分別約為7.31、7.30和7.31 min，色譜峰峰形較佳，峰間隔時(shí)間較長(zhǎng)，且均為基線分離峰?？瞻滋崛∫涸谏鲜鰰r(shí)間無(wú)干擾峰出現(xiàn)，以雞肝臟中AMP的高效液相色譜圖為例，具體見(jiàn)圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以氨芐西林的色譜峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣前氨芐西林的質(zhì)量濃度（X）作圖，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨芐西林在25～1 000 μg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好。氨芐西林的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見(jiàn)表1。

2.3 樣品的回收率及精密度

由表2可知，在添加水平分別為10、25、50和100 μg/kg時(shí)，雞肌肉樣品中AMP的平均回收率為76.53%～85.87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.48%～8.82%；雞肝臟樣品中AMP的平均回收率為75.31%～83.31%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.29%～10.20%；雞腎臟樣品中AMP的平均回收率為78.76%～84.26%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.46%～9.29%。通過(guò)對(duì)樣品精密度進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，氨芐西林在雞肌肉、肝臟和腎臟中的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別低于8.77%、9.21%和8.99%；日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別低于12.78%、11.64%和12.54%，結(jié)果表明該方法可靠，重復(fù)性高。

2.4 靈敏度

應(yīng)用該試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法測(cè)得雞組織（肌肉、肝臟和腎臟）中氨芐西林的檢測(cè)限和定量限均分別為3.5（S/N=3）和10.0 μg/kg（S/N=10）。由表2可知，添加濃度為10.0 μg/kg時(shí)，氨芐西林在雞組織中的回收率均大于70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%，表明該方法在定量限水平的可靠性好[8]，且靈敏度高，完全能滿足氨芐西林在雞組織中殘留檢測(cè)的需要。

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇及優(yōu)化

動(dòng)物源食品中基質(zhì)干擾復(fù)雜，富含大量脂肪和蛋白質(zhì)，選擇并優(yōu)化樣品前處理方法對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性顯得尤為重要。樣品的提取的目的在于同時(shí)去蛋白和萃取目標(biāo)化合物。Capriotti等[9]分別比較了用80∶20（V/V）的甲醇：水、乙腈：水、丙酮：水提取雞蛋中的多種抗生素殘留，3種提取溶劑提取氨芐西林的回收率分別為27%、19%

和0%；還比較了酸性的磷酸鹽緩沖液提取液以及中性的甲醇和水混合提取液的提取效果，前者的回收率高。筆者經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)比較了乙腈和甲醇的去蛋白提取藥物的效果，發(fā)現(xiàn)用乙腈的效果要較甲醇好，這可能與樣品基質(zhì)的不同有關(guān)。樣品提取后，為了阻止氨芐西林與大分子形成共價(jià)鍵，阻礙衍生反應(yīng)的進(jìn)行，再次加入乙腈沉淀蛋白并去除非極性干擾物。采用該方法提取的回收率均在70%以上，可滿足獸藥殘留分析的要求。

42卷20期 孫禮瑞等 高效液相色譜熒光檢測(cè)法檢測(cè)雞組織中氨芐西林殘留量

3.2 樣品凈化方法的選擇及優(yōu)化

樣品經(jīng)提取后提取液中目標(biāo)分析物含量較低，且許多與待測(cè)組分溶解性相似的雜質(zhì)將被一起轉(zhuǎn)移出來(lái)，故該試驗(yàn)在對(duì)樣品進(jìn)行提取和沉淀蛋白后還需要進(jìn)行凈化。目前獸藥殘留分析較常用的凈化方法有固相萃取法和液液萃取法，目前國(guó)內(nèi)外多數(shù)分析試驗(yàn)的前處理過(guò)程采用固相萃取裝置[10-14]。筆者在凈化階段對(duì)比了不同SPE小柱對(duì)分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用SPE小柱進(jìn)行凈化的回收率為63%～92%，而采用乙腈去除蛋白，正己烷脫脂，然后利用氨芐西林易溶于水中，而不溶于二氯甲烷的性質(zhì)，用二氯甲烷對(duì)有機(jī)試劑進(jìn)行萃取去除，從而達(dá)到分離效果，回收率可達(dá)68.65%～88.86%，操作簡(jiǎn)單且完全能滿足農(nóng)業(yè)部關(guān)于《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》的要求[15]?？紤]到經(jīng)