‘四季蜜’龍眼花芽總蛋白質(zhì)提取方法及雙向電泳體系的優(yōu)化

歐高政 陳清西

摘 要 利用TCA丙酮法、丙酮法、TCA酚抽提法和改良酚抽法等4種方法，提取‘四季蜜龍眼花芽的總蛋白質(zhì)，在蛋白產(chǎn)量、單向SDS-PAGE和2-DE圖譜等方面進行比較，并對IPG膠條種類、蛋白質(zhì)上樣量及等電聚焦條件等進行優(yōu)化。結(jié)果表明：采用改良酚抽法，選用24 cm、pH3～10的膠條，按120 μg上樣，在適宜的等電聚焦條件下，可獲得背景清晰、重復性好、分辨率高的2-DE圖譜，本研究為‘四季蜜龍眼花芽蛋白質(zhì)組學后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ‘四季蜜龍眼；花芽；總蛋白；提取方法；雙向電泳

中圖分類號 S667.201 文獻標識碼 A

Method of Total Protein Isolation from Floral Buds of Longan

（Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi）and Optimization

of Two-dimensional Electrophoresis System

OU Gaozheng1，2，CHEN Qingxi1 *

1 College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350119， China

Abstract The total protein in the floral buds of Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi was extracted with four methods，namely trichloroacetic acid（TCA）-acetone，acetone，TCA/phenol and improved phenol，and compared by protein production，one-way SDS-PAGE and 2-DE. The sample loading quantity，the gel concentration and the key process of IEF were also optimized. The result showed that the improved phenol extraction protocol was the best method for floral buds. And a high quality 2-DE map with low background was obtained using the following optimized procedure：loading 120 μg protein sample on 24 cm IPG strip with pH3-10. The study built up a good basis for the future proteomics research in D. longan（Lour. Cv Sijimi）.

Key words Dimocarpus longan Lour. Cv Sijimi； Floral buds； Total protein； Extraction method； Two-dimensional electrophoresis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.010

‘四季蜜龍眼一年四季均能自然開花結(jié)果，該品種在自然條件下，成花不需低溫和干旱條件，花芽分化、開花和座果在高溫下仍能正常進行，其特殊的開花習性為研究龍眼周年生產(chǎn)提供了便利。通過雙向電泳技術(shù)分析‘四季蜜龍眼成花過程蛋白質(zhì)圖譜的差異，尋找與成花相關(guān)的蛋白質(zhì)并進一步分離相關(guān)基因，對調(diào)控龍眼成花有重要理論意義。但龍眼屬于頑拗性植物，芽中含有大量的酚類、多糖及色素等干擾物質(zhì)，不利于總蛋白質(zhì)的提取。雖然前人研究龍眼成花逆轉(zhuǎn)時曾對普通龍眼花葉芽進行過提取，但是所用方法不同，效果也不一樣[1-2]，因此有必要對‘四季蜜龍眼芽的總蛋白質(zhì)提取方法和雙向電泳體系進行優(yōu)化，以期為進一步研究龍眼花芽分化相關(guān)的蛋白質(zhì)組學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料于2012年8月采于福建省云霄縣源發(fā)農(nóng)場，選擇正常掛果的‘四季蜜龍眼成年樹，選取新梢基部直徑>0.5 cm的頂芽，用經(jīng)凈化處理的鑷子將花芽的鱗片去除后置于冰盒中帶回實驗室，用液氮處理后放入-40 ℃冰箱備用。

1.1.2 主要儀器與試劑 IPG phor III等電聚焦儀、Ettan DALT six中高通量二向垂直電泳系統(tǒng)、Imagescanner II掃描系統(tǒng)均為GE公司產(chǎn)品；DYCZ-24EN垂直電泳儀，為北京六一儀器廠產(chǎn)品；HX-1050恒溫循環(huán)器，為德天佑公司產(chǎn)品。

固相pH梯度干膠條（IPG干膠條，pH4～7，13 cm、18 cm）、IPG buffer（pH3～10；pH4～7）、Pharmylte、二硫蘇糖醇（DTT）和碘乙酰胺（Iodacetamide）均購自GE公司；丙烯酰胺（Acrylamide）、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、CHAPS均購自Amresco公司；Tris-base、溴酚藍、蛋白Marker、EDTA-2Na、三氯乙酸（TCA）、pH7.8 Tris飽和酚、十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、過硫酸銨（AP）、TEMED、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、無水碳酸鈉（Na2CO3）、甘氨酸（Glycine）、牛血清白蛋白（BSA）、考馬斯亮藍R-250/G-250、β-疏基乙醇（β-ME）、瓊脂糖等購于上海生工。冰醋酸、丙酮、無水乙醇、無水甲醇、醋酸氨、硝酸銀、甲醛等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 總蛋白質(zhì)提取方法

（1）TCA/丙酮法。參照賴呈純等的方法[3]稍加改進。稱取1.0 g供試材料，加入液氮研成粉末，移入10 mL離心管中，加入4倍體積預冷的丙酮（含100 g/L TCA，體積分數(shù)0.07% β-巰基乙醇），充分渦旋后-20 ℃下靜置6 h或過夜，以使蛋白充分沉降，后按方法步驟進行，將沉淀置于-20 ℃冰柜中，使殘留的丙酮揮發(fā)干凈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）丙酮法。參照范海延等的方法[4]稍加改進。供試材料研磨采用含0.07% β-巰基乙醇預冷的丙酮制成勻漿，充分渦旋后置于-20 ℃沉降1 h，后按方法進行，最后將沉淀置于-20 ℃冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）TCA/酚提法。參照Wang W等[5]的方法稍加改進。供試材料首次所得沉淀用冷丙酮再洗1次，把沉淀轉(zhuǎn)入研缽，室溫揮發(fā)干丙酮，轉(zhuǎn)入新的離心管，加入1 mL丙酮（含100 g/L TCA，體積分數(shù)0.07% β-巰基乙醇）洗滌3次，直至沉淀無色。后按方法步驟進行，最后沉淀-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）改良酚提法。參考Saravanan等[6]方法加以改進。稱取1.0 g材料，加入液氮研磨成粉（加入20% PVPP研磨），加入5倍體積的0.07% 2-ME/冷丙酮，振蕩渦旋，4 ℃，15 000 g/min離心10 min，重復2次。抽干丙酮，轉(zhuǎn)入新的研磨，再用液氮研磨成更細粉末，加入4 mL SDS緩沖液，渦旋，充分混勻，4 ℃放置30 min（每隔10 min 振蕩1次），加入等體積的pH7.8 Tris飽和酚，渦旋振蕩，放置-20 ℃ 30 min（每隔10 min振蕩一次），4 ℃，15 000 g/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層酚相，加入等體積SDS緩沖液重復抽2次，渦旋充分混勻，4 ℃，15 000 g/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層酚相（分成2份），加入5倍體積0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液，置-20 ℃至少4 h或過夜，4 ℃，15 000 g/min離心15 min，沉淀用5 mL 0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液洗3次，80%冷丙酮洗2次，晾干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)定量 參照Bradford法[7]測定樣品中總蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 電泳方法 SDS-PAGE電泳采用Laemm Li的方法[8]，用4%濃縮膠和12.5%分離膠，考馬斯亮藍染色。雙向電泳用裂解液[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%（W/V）CHAPS，2%（V/V）pharmalyte，60 mmol/L DTT（現(xiàn)加）]溶解蛋白，4 ℃，15 000 g/min離心15 min，取上清加入水化液[8 mol/L尿素，2%（W/V）Chaps，1%（V/V）IPG緩沖液，40 mmol/L DTT，2%溴酚藍]上樣。IPG干膠條pH分別為3～10、4～7，長度分別為18 cm、24 cm，水化液與樣品終體積分別為340 μL、450 μL，進行等電聚焦，18 cm等電聚焦參數(shù)見表1。將聚焦好的IPG膠條用平衡液Ⅰ（100 mg/10 mL DTT）和平衡液Ⅱ（250 mg/10 mL碘乙酰胺）依次平衡15 min。第二向電泳采用12.5% SDS聚丙烯酰胺凝膠。

1.2.4 凝膠染色及圖像分析 電泳后的凝膠染色參照郭堯君[9]的銀染法。染色后使用Imagescanner II系統(tǒng)進行掃描，并用Image MasterTM 2D Platinum software7.0分析軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法蛋白產(chǎn)量及單向SDS-PAGE電泳比較

‘四季蜜龍眼花芽4種蛋白質(zhì)提取方法的比較見表2，由表2可知，在4種提取方法中，雖然TCA/丙酮法和丙酮法獲得的蛋白質(zhì)干粉遠多于TCA/酚抽提法和改良酚抽法，但在提取所得的蛋白產(chǎn)量上存在顯著的差異。改良酚抽法得率最高，為（3.18±0.12）mg/g FW，TCA/酚提法可獲得蛋白量為（2.706±0.06）mg/g FW，兩者差異不明顯，但與TCA/丙酮、丙酮法達極顯著差異。因此從蛋白質(zhì)產(chǎn)量看，樣品經(jīng)過酚抽提效果明顯增強。

將提取的蛋白按上樣量50 μg進行單向SDS-PAGE電泳（圖1），4種方法提取的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后條帶數(shù)目以及染色深淺均有一定的差異，改良酚提法與小量酚提法均得到明顯的條帶數(shù)，其分離效果明顯，說明酚提所得的蛋白質(zhì)質(zhì)量好；TCA-丙酮法僅得到微弱的條帶，可能含有較多的雜質(zhì)；丙酮法提取的蛋白電泳檢測后幾乎沒有條帶。因此，從單項SDS-PAGE電泳來看，酚抽提的效果要優(yōu)于丙酮沉降。

2.2 不同上樣量對雙向電泳圖譜的影響

上樣量的大小影響著2-DE圖譜效果（圖2）。由于植物中蛋白質(zhì)表達豐度不同，上樣量低就會造成某些低豐度蛋白無法顯示，影響蛋白的檢測；但是如果上樣量過高，又有可能造成斑點的交叉，影響低豐度蛋白的分離，且過高的上樣量也會使鹽和雜質(zhì)的含量提高，影響等電聚焦效果。本研究選取蛋白獲得量最多、單向SDS-PAGE效果好的改良酚提法進行上樣量比對，綜合考慮染色方法的靈敏度、前期重復試驗的結(jié)果，并參考前人的相關(guān)研究[10-11]，選取了18 cm pH4～7的IPG膠條，設定了90、100、120、150 μg 4個梯度進行比較，從圖2-C中可見，蛋白質(zhì)點分布均勻，背景清晰，聚焦效果良好，圖2-A中蛋白點過少，圖2-B中蛋白點有所增加，但相較2-C而言，仍有許多蛋白點未能有效表達，圖2-D中背景受到一定的影響，且有些點過表達，干擾了低豐度蛋白的檢測。因此認為在‘四季蜜龍眼芽蛋白雙向電泳中，選擇120 μg上樣量可取到良好的效果。

2.3 不同提取方法對2-DE圖譜的影響

在確定上樣量后，對不同提取方法進行了2-DE圖譜比較，結(jié)果見圖3。在4種提取方法中，TCA/丙酮法能獲得少量的蛋白點，丙酮法則僅有極少的點，其結(jié)果與單向SDS-PAGE相同，說明單向SDS-PAGE有指示作用，但導致單向SDS-PAGE中丙酮法沒有檢測到條帶的原因可能與蛋白濃度偏低有關(guān)。從圖3-D可見，改良酚提法的提取效果最好，經(jīng)過分析軟件檢測可得到約637個蛋白點，要優(yōu)于其他3種方法，因此改良酚提法比較有利于‘四季蜜龍眼芽總蛋白的提取。

2.4 不同電泳體系對2-DE圖譜的影響

分別采用pH3～10和pH4～7的24 cm IPG膠條對‘四季蜜龍眼花芽蛋白質(zhì)進行分離，結(jié)果表明，采用pH3～10的IPG膠條得到了全范圍的蛋白質(zhì)點，經(jīng)過Image MasterTM 2D軟件分析共得到1 427個蛋白點；而pH4～7的IPG膠條只獲得了約819個蛋白點，明顯少，且堿性端蛋白質(zhì)點完全缺失，故要深入進行差異蛋白的分析，宜選用pH3～10的IPG膠條進行下一步研究。

第一向IEF中，聚焦電壓是電泳圖譜優(yōu)劣的關(guān)鍵因素之一。如果在設定時間內(nèi)達不到聚焦電壓，則有部分蛋白點無法進入膠條中，也就影響了蛋白點的顯示；如果聚焦過度，則背景過深，蛋白點模糊。本研究設定了24 000、32 000、40 000 Vh 3個梯度進行比較，通過Image MasterTM 2D軟件分析不同等電聚焦強度下的凝膠圖譜，結(jié)果表明等電聚焦時間達到32 000 Vh，背景干凈，蛋白點清晰，無論對于高豐度和低豐度蛋白都有較好的分離效果，而24 000 Vh時高豐度蛋白無法有效分離，低豐度蛋白則有些未能顯現(xiàn)，40 000 Vh時背景偏深，且有些蛋白點出現(xiàn)拖尾或粘連，不利于后面的蛋白質(zhì)分析，因此等電聚焦選擇32 000 Vh有利于24 cm的雙向電泳分析（圖5）。

通過對聚焦電壓的比對、優(yōu)化，以及研究過程中對整個等電聚焦運行程序的反復試驗，得出了較為優(yōu)化的IEF參數(shù)，優(yōu)化后的電泳參數(shù)見表3。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)樣品的制備是雙向電泳的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提取所得蛋白質(zhì)質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到雙向電泳的分辨率、重復性，進而影響后續(xù)研究的開展，如質(zhì)譜分析、差異蛋白比對等。TCA/丙酮法作為目前植物組織蛋白質(zhì)提取最常用的方法，在許多植物組織上都獲得了很好的效果，但主要集中在葉片、果皮上[12-16]，而對于種子、胚性愈傷組織、花器官等的效果則相對較弱。本研究中，筆者經(jīng)過多次重復試驗發(fā)現(xiàn)，TCA/丙酮法在堿端會產(chǎn)生一個暗色區(qū)域，這說明其中含有一些較高濃度的鹽離子，這些離子的存在影響了堿性端蛋白質(zhì)的分辨，不利于后期的研究。丙酮法由于步驟簡單，所得干粉中可能含有雜質(zhì)，影響了蛋白的有效表達，使得IEF中聚焦不完全，從而無法得到相應的點。而TCA/酚提法，從單向SDS-PAGE的效果來看，其提取的完整性較好，而且也能得到較為清晰的圖譜，但是可能由于其量較少，導致蛋白數(shù)目偏少，許多微量表達的蛋白沒法顯示出來。改良酚提法在研磨時加入20% PVPP可有效去除花芽中的酚、醌類、色素等物質(zhì)；并在丙酮抽提后進行二次研磨，可使得所得粉末更細，利于后面非蛋白物質(zhì)的去除，筆者重復研究發(fā)現(xiàn)酚抽提后用SDS緩沖液重復抽提，能提高蛋白純度，使蛋白質(zhì)產(chǎn)量相應增加，利于后期的2-DE研究。對比4種提取方法后，結(jié)果表明，改良酚抽提法更適合于‘四季蜜龍眼花芽蛋白的提取，蛋白質(zhì)含量高，質(zhì)量好，蛋白點能均勻地分布在凝膠上。

等電聚焦運行程序的參數(shù)設定對2-D效果影響很大，聚焦不足或過度聚焦都會對2-D圖譜造成影響。在過往研究中，人們多數(shù)關(guān)注上升到8 000 V或10 000 V后的等電聚焦時間[17-18]。而本研究發(fā)現(xiàn)，將水化時間從10～12 h延長至15 h，可提高凝膠上的蛋白點數(shù)，這可能是由于干膠條在低壓下充分泡漲，水化液中的蛋白盡數(shù)進入膠條的原因。此外，在進行聚焦程序時，將伏小時數(shù)設置到32 000 Vh，可使每個蛋白點清晰，所得2-D圖譜分離效果較為理想。

通過反復的試驗比較，優(yōu)化了‘四季蜜龍眼芽總蛋白提取及雙向電泳技術(shù)：取1.0 g芽體材料，運用改良酚提法提取，以120 μg為上樣量，選擇pH3～10長度24 cm的膠條，運用如表3的參數(shù)進行雙向電泳，可獲得清晰的蛋白圖譜，對于‘四季蜜龍眼花芽分化機理的研究具有重要意義。

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責任編輯：葉慶亮