橡膠樹抗病相關(guān)基因HbNPR1的克隆及其表達分析

李博勛等

摘 要 前期利用cDNA-AFLP技術(shù)分離獲得了一個與橡膠樹抗棒孢霉落葉病反應(yīng)相關(guān)的差異表達基因片段EST-IAN-188，通過Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，該基因片段與植物抗病相關(guān)NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性。將該片段與橡膠樹基因組序列進行比對，設(shè)計引物進行PCR擴增，得到了一個橡膠樹NPR1基因的cDNA和基因組序列，命名為HbNPR1基因?；蛐蛄蟹治鲲@示，該基因編碼區(qū)全長（CDS）1 374 nt，含有兩個外顯子和一個內(nèi)含子，編碼457個氨基酸，蛋白分子量為51.0 ku，等電點5.82，具有BTB/POZ、ANK 錨蛋白重復(fù)序列、DUF和NPR1-like C等4個結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR 定量分析發(fā)現(xiàn)，HbNPR1基因在橡膠葉片中的表達豐度最高，特別是古銅期葉片；多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）誘導(dǎo)下HbNPR1基因在抗病品種（IAN873）的表達豐度明顯高于感病品種（PR107）；另外，SA、MeJA、ET處理下均能誘導(dǎo)HbNPR1基因的表達，SA處理后的表達量豐度最高。本研究初步表明，HbNPR1基因可能參與橡膠樹抗病信號途徑的調(diào)控和寄主對病原菌侵染的防御反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；HbNPR1基因；克??；表達分析

中圖分類號 S794.1；Q78 文獻標(biāo)識碼 A

Cloning and Expression Analysis of Resistance-related

Gene HbNPR1 from Hevea brasiliensis

LI Boxun，SHI Tao，LIN Chunhua，LIU xianbao，CAI Jimiao，HUANG Guixiu*

1 Agronomy college， Hainan University， Haikou， Hainan 570228，Chiana

2 Environment and Plant Protection Institute， CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Tropical Crops， Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and

Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou， Hainan 571101，Chiana

Abstract A resistance related differential expression fragment of rubber tree to Corynespora leaf fall disease was obtained in pre-work， and named as EST-IAN-188. Blast showed that the fragment had high homology with NPR1， a plant resistance NPR gene family member. Based on the Hevea brasiliensis genome database， the long fragment including EST-IAN-188 was gained and Hevea NPR1 gene was cloned， named as HbNPR1. Sequence analysis revealed that the CDS length of HbNPR1 was 1 374 nt， encoding a protein of 457 amino acids with an average molecular weight of 51.0 ku， and a pI value of 5.82. Exon/intron structure analysis revealed 2 exons and 1 introns in HbNPR1 genomic sequence. The protein had four conserved domains of BTB/POZ， ANK anchored protein repeat sequences， DUF and NPR1-like C. The expression pattern of HbNPR1 in rubber plants was assessed by qRT-PCR. The tissue-specific expression analysis indicated that the HbNPR1 was mainly expressed in leaves， especially in the bronze blade. When C. cassiicola infected， the expression level of HbNPR1 was significantly higher in resistant rubber germplasm（IAN873） than in susceptible rubber germplasm（PR107）. The expressions of HbNPR1 were up-regulated by ethylene、salicylic acid and Methyl jasmonate treatment， especially by salicylic acid. The results preliminarily show that HbNPR1 gene may be involved in rubber tree resistance signal pathway.

Key words Hevea brasiliensis；Gene HbNPR1；Cloning；Expression Analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.007

植物抗病相關(guān)基因非表達子NPR1是植物抗病信號傳導(dǎo)途徑中起調(diào)控作用的關(guān)鍵基因。該基因不僅對植物系統(tǒng)獲得抗性（SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）起作用，而且是由抗病基因（R gene）決定抗性的重要調(diào)控因子，在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[1]。NPR1基因最早是Cao等[2]在模式植物擬南芥中克隆得到的，并證明該基因是SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中作用于水楊酸（SA）信號途徑下游的一個關(guān)鍵性調(diào)控因子，其W-box序列能與WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活NPR1來啟動下游PR基因與病原菌直接作用，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）[2-3]。早期研究中，Ekengren等[4]沉默了NPR1及其互作的轉(zhuǎn)錄因子TGA1a和TGA2.2，發(fā)現(xiàn)番茄植株喪失了pto決定的對Pseudomonas syringaepv的抗性，表現(xiàn)出病害癥狀。隨后Zhang等[5]又發(fā)現(xiàn)NPR1的時序表達與番茄抗病基因cf決定的過敏性壞死和抗性產(chǎn)生的時序性呈正相關(guān)，又進一步證明了NPR1在植物抗病基因R基因決定的抗性中的關(guān)鍵作用。在抗病信號傳導(dǎo)途徑中，水楊酸（SA）是誘發(fā)SAR產(chǎn)生的關(guān)鍵信號分子之一，茉莉酸（JA）和乙烯（ET）則為誘發(fā)ISR產(chǎn)生的關(guān)鍵信號分子，而NPR1既是水楊酸，又是茉莉酸和乙烯介導(dǎo)的抗病信號傳導(dǎo)途徑中起重要調(diào)控作用的基因，協(xié)調(diào)和平衡各信號途徑的傳導(dǎo)[6]。此外，在水稻、煙草、番茄等植物中都分離并克隆到與NPR1同源的基因，這些基因在介導(dǎo)植物抗病信號傳導(dǎo)途徑中都發(fā)揮著重要作用，而橡膠樹中的NPR1基因是否也具有相似的功能，還有待進一步研究。

橡膠樹棒孢霉落葉?。–orynespora leaf fall disease，CLFD）是近20多年來影響國際橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的葉部病害之一，主要造成橡膠葉片的大量脫落，植株長勢降低甚至枯死，在亞洲，約有94%的橡膠產(chǎn)地都有該病為害，嚴(yán)重發(fā)生時可以導(dǎo)致干膠產(chǎn)量損失達20%～25%[7]，目前尚無十分有效的防治方法來控制該病害的發(fā)生。筆者前期利用cDNA-AFLP技術(shù)篩選到一個與橡膠樹抗棒孢霉落葉病反應(yīng)相關(guān)的基因片段EST-IAN-188，該基因片段與植物抗病相關(guān)NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性，目前有關(guān)NPR1基因在橡膠樹中的作用機理和表達特性等研究國內(nèi)外都未見報道。因此，本文對橡膠樹NPR1基因進行克隆，通過qRT-PCR分析該基因的組織表達特性，分析病原菌誘導(dǎo)后在橡膠樹抗病和感病種質(zhì)中的表達差異，以及不同外源激素處理后的表達特性，為揭示NPR1基因在橡膠樹中的作用機理以及橡膠樹分子抗病機制提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和橡膠樹品種 多主棒孢菌株HCCYN49由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所分離并保存。橡膠樹品種IAN873和PR107定植于2010年，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 HCCYN49菌株采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，配方參照《植病研究方法》[8]。TransZol Plant RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、Taq酶、dNTPs、DNA Maker、pMD18-T Vector Kit等生化試劑購自TaKaRa公司，引物由北京六合華大基因有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 植物材料處理 采用時濤[9]的方法制備濃度為1.0×106個孢子/mL的孢子懸浮液，參照Cai Zhiying[10]的方法噴霧接種到抗、感品種淡綠期的橡膠葉片上；配制濃度為0.2 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、0.5 mmol/L水楊酸（SA）、0.1%乙烯（ET）分別處理抗病品種（IAN873）和感病品種（PR107）淡綠期的橡膠葉片，均以滅菌水作為對照于接種后12、24、48和72 h的時間段取樣。采集抗病品種（IAN873）不同組織（根、莖、淡綠期葉片）和不同物候期（古銅期、淡綠期、老葉期）橡膠葉片，迅速凍于液氮，后貯存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA和總RNA提取 參照許玲[11]方法，對IAN873淡綠期葉片DNA進行提取。方法參照“TransZol Plant”說明書提取橡膠葉片和不同組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA合成參照“PrimeScriptR RT reagent Kit With gDNA Eraser”說明書進行。

1.2.3 cDNA全長及基因組序列的克隆 將差異片段序列在NCBI網(wǎng)站上利用Blastn程序進行同源性比對分析，同時與中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所提供的橡膠樹品種‘熱研7-33-97基因組序列進行比對，獲得包含該基因片段的大片段序列，將該序列在Softberry（http：//www.softberry.com）上進行目的基因的預(yù)測，獲得NPR1基因的 cDNA和基因組序列，結(jié)合搜索得到的cDNA和基因全長序列設(shè)計特異性引物，全長cDNA擴增引物為HbNPR1 F1： 5′-ATCTGTGTATCTGTTGCTCT-3′、HbNPR1 R2： 5′-CCAATCATTCTCTCTTAGGA-3′基因組序列擴增引物為HbNPR1 F3： 5′-ATCTCCCTTTGGTCTC

CTCT- 3′、 HbNPR1 R4： 5′-GATTCTCTCTTACTA

ACCCT-3′。PCR反應(yīng)體系為10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，Taq DNA poly-

erase（5 U/μL）0.3 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，模板（30 ng）1 μL， 加水補足至25 μL。反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性3 min， 94 ℃變性30 s， 58 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min， 35個循環(huán)， 72 ℃延伸10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得目的片段經(jīng)凝膠回收純化試劑盒回收連接到pMD18-T載體上送公司測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件分析目的基因編碼的氨基酸序列，ProtParam軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析其蛋白質(zhì)大小、等電點等信息，ProSeale軟件（http：//web. expasy.org/protscale/）軟件分析蛋白質(zhì)疏水性，InterProScan 軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprs

can/）分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及保守域。同時，下載近源物種的同源基因氨基酸序列，用MEGA version5.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap對系統(tǒng)樹進行檢驗，1 000次重復(fù)。

1.2.5 目的基因在橡膠樹抗、感品種受多主棒孢侵染后的差異表達分析 基于目的基因序列設(shè)計熒光表達特異引物，采用實時熒光定量PCR來分析其表達特性。以組成型表達基因18s rRNA做為內(nèi)參基因，設(shè)計引物18SS（5′-GCTCGAAGACGATCA

GATA CC-3′）和18SA（5′-TTCAGCCTTGCGACCA

TAC-3′）。按照Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡPerfect Real Time（Code： DRR081A）提供的說明書在ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System上進行熒光定量PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-IAN-188差異片段序列比對及其基因預(yù)測

將EST-IAN-188差異片段序列與橡膠樹全基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果與P99.08_scaffold2170的部分序列完全一致，選取其上下游各2.0 kb序列，將序列在Softberry數(shù)據(jù)庫分別用橡膠樹、煙草、擬南芥、番茄和苜蓿等模式進行基因預(yù)測，結(jié)果均表明該片段含有一個目的基因，該基因轉(zhuǎn)錄起始位點位于第103 nt處，polyA位點位于第2 655 nt處，有兩個外顯子。除擬南芥和番茄外，其余幾種模式植物基因預(yù)測結(jié)果完全一致（如圖1 a-c）。

2.2 目的基因的克隆及推導(dǎo)蛋白分析

本研究分別以IAN873和PR107兩個橡膠樹品種的cDNA和DNA作為模板 ，進行PCR和RT-PCR的擴增。結(jié)果顯示：以cDNA為模板，在抗、感品種中均能擴增得到一條1.3 kb左右的目的條帶；以DNA為模板抗、感品種中同樣均能擴增得到一條2.6 kb左右的條帶（圖2），說明HbNPR1在橡膠樹抗病和感病品種中都存在。經(jīng)克隆、測序和序列分析發(fā)現(xiàn)，本研究得到一個橡膠樹NPR1基因的cDNA和基因全長序列命名為HbNPR1，其cDNA序列已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號：KF753695。通過序列分析，推測該基因含有一個內(nèi)含子和兩個外顯子，在啟動子區(qū)有兩個W-box序列（TTGAC）（圖3），該序列是不同來源NPR1基因共有的核心啟動元件。基因編碼區(qū)全長1 374 nt，推測編碼457個氨基酸，蛋白的分子質(zhì)量為51.0 Ku，等電點為5.82。其氨基酸序列分別與蓖麻（XP_002514127.1）、三角楊樹（XP_002308281.1）、可可（ADI24348.1）、葡萄（XP_002281475.1）等NPR1蛋白的氨基酸序列同源性較高，分別達到了89%、82%、79%和76%。用InterProScan工具對HbNPR1基因的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，并結(jié)合NCBI的結(jié)果對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析表明，該基因具有植物NPR1所共有的保守結(jié)構(gòu)域，含有BTB/POZ結(jié)構(gòu)域、ANK 錨蛋白重復(fù)序列、DUF和NPR1-like C等4個結(jié)構(gòu)域（圖4）。通過氨基酸序列多重比對分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹HbNPR1與蓖麻、可可、三角楊的NPR1氨基酸序列之間具有很高的相似性（圖5）。

2.3 HbNPR1的系統(tǒng)進化樹分析

為了明確所克隆的HbNPR1基因的系統(tǒng)進化情況，筆者根據(jù)Blast比對結(jié)果從公共數(shù)據(jù)庫下載了與HbNPR1基因同源性較高的11種植物NPR1基因的氨基酸序列，與本研究HbNPR1基因的氨基酸序列一起建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示（圖6），橡膠HbNPR1基因與蓖麻聚在一個分枝上，親緣關(guān)系最近，這可能與它們同為大戟科的分類地位一致有關(guān)，另外橡膠與同為楊柳科的三角楊和大葉楊的親緣關(guān)系也較近，都屬于高大的喬木而被聚到了一個大的分枝上，而與茄科的辣椒和煙草，旋花科（甘薯），豆科（苜蓿）、葡萄科（葡萄）等的親緣關(guān)系較遠。

2.4 HbNPR1基因的組織表達特性分析

采用實時熒光定量PCR分析不同組織（根、莖、葉）和不同物候期橡膠葉片（古銅期、淡綠期、老葉期）HbNPR1基因的表達特性，結(jié)果表明（圖7），HbNPR1基因在各組織和各物候期均能表達，但其表達量在不同部位差異顯著；HbNPR1在葉片中的表達豐度最高，其次是莖，根部的表達量最低；另外HbNPR1基因在古銅期葉片中呈高豐度表達，淡綠期和老葉期的表達豐度相對較低。該基因在古銅期葉片的表達量最高，推測與其參與橡膠樹系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）的作用有關(guān)。

2.5 多主棒孢病菌和不同外源激素誘導(dǎo)對HbNPR1基因表達的影響

目前已知的抗病信號傳導(dǎo)途徑主要包括水楊酸（SA），乙烯（ET）和茉莉酸（JA）介導(dǎo)的途徑，它們參與不同類型抗性的調(diào)控[12]。如SAR主要通過水楊酸介導(dǎo)的途徑，而ISR則通過乙烯和茉莉酸介導(dǎo)的途徑來激活產(chǎn)生。用qRT-PCR分析橡膠葉片受多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）和不同外源激素（茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯）誘導(dǎo)下HbNPR1基因的表達特性，結(jié)果表明（圖8），在0.5 mmol/L水楊酸、0.2 mmmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）和0.1%乙烯處理下HbNPR1基因均能上調(diào)表達，推測該基因在橡膠樹3個信號途徑中都能起調(diào)控作用，但水楊酸處理后的表達量比茉莉酸甲酯和乙烯處理后的表達量高，且不同時間處理下的表達量差異顯著，說明該基因在橡膠樹中主要參與水楊酸信號途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)。HbNPR1基因在水楊酸、茉莉酸甲酯和乙烯處理后24 h表達量達到最高，之后除茉莉酸甲酯外，水楊酸和乙烯處理48 h和72 h后的表達量都顯著下降，但仍顯著高于未處理的表達量，說明外源激素的處理能誘導(dǎo)HbNPR1基因的表達，且處理不同時間表達量差異顯著。多主棒孢病菌接種抗病和感病橡膠葉片后發(fā)現(xiàn)，HbNPR1基因在抗?。↖AN873）和感?。≒R107）橡膠葉片中都能被該病菌誘導(dǎo)表達，但抗病品種中的表達量明顯高于感病品種，從未接種病原菌前抗病品種的表達量就顯著高于感病品種，接種12 h后感病品種的表達量略高于抗病品種，24 h后兩個品種的表達量都達到最高值，且抗病品種顯著高于感病品種，之后抗病品種的表達量都高于感病品種，進一步推測病原菌誘導(dǎo)能促進HbNPR1基因表達量的升高，但在抗病和感病橡膠品種中的表達模式不同。

3 討論與結(jié)論

項目組前期研究中獲得了一個與NPR家族蛋白具有高度同源性的EST特異性表達序列（EST-IAN-188），本研究將該序列與橡膠樹全基因組數(shù)據(jù)庫進行本地Blast比對，從橡膠樹中克隆得到一個NPR1基因，將其命名為HbNPR1。序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因在氨基酸序列與蓖麻、三角楊樹、可可的NPR1具有很高的同源性，在進化上與蓖麻的親緣關(guān)系最近；氨基酸序列分析表明，橡膠樹HbNPR1基因含有植物NPR1蛋白所共有的保守結(jié)構(gòu)域，其中ANK結(jié)構(gòu)域是NPR1基因與TGA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的必要元件，正向調(diào)控PR基因的表達，使植物產(chǎn)生SAR；NPR1-like C結(jié)構(gòu)域含有兩個保守序列LENRV和DLN，該結(jié)構(gòu)在抗病信號傳遞途徑中起重要的調(diào)節(jié)作用[13]；NPR1蛋白C-末端的核定位序列（NLS）能使NPR1單體在細胞核內(nèi)積累，從而激活下游防衛(wèi)基因表達；另外在橡膠HbNPR1基因的啟動子區(qū)域含有2個W-box序列（TTGAC），擬南芥的AtNPR1基因有3個[14]，荊州黑麥ScNPR1基因有4個[11]，Yu等[15]研究證明W-box序列能與轉(zhuǎn)錄因子WAKY相結(jié)合，正向調(diào)控NPR1表達，從而激活下游因子，增強PR基因的表達，使植物產(chǎn)生抗性。

NPR1的組織特異性表達研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtNPR1基因、水稻OsNPR1基因均無組織特異性表達[16]，而荊州黑麥ScNPR1基因在根、莖、葉、穗、節(jié)中均有表達，在葉和莖表達量較高，具有一定的組織表達差異；本研究中HbNPR1基因在根、莖、葉中也均有表達，且表達豐度存在明顯差異，在葉片中的表達豐度最高，其次是莖，根的表達豐度最低；在不同物候期橡膠葉片中，古銅期的表達豐度最高。該基因在橡膠樹不同組織和不同物候期葉片的表達差異是否與其參與調(diào)控抵御病原菌的作用有關(guān)還有待進一步的證實。

NPR1作為多種信號途徑的交叉點，與WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在調(diào)節(jié)和平衡水楊酸和茉莉酸等信號傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用。Spoel等[17]發(fā)現(xiàn)，接種PstDC3000后，NahG轉(zhuǎn)基因植株不能積累水楊酸，但其茉莉酸含量增加25倍，同時茉莉酸信號傳導(dǎo)基因的表達也顯著增強，而npr1突變株中，這種抑制作用顯著減弱，表明NPR1在水楊酸信號傳導(dǎo)途徑抑制茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵作用。Alvarez等發(fā)現(xiàn)用水楊酸處理或病原菌侵染可以使擬南芥AtNPR1的表達量比未處理前增加2～3倍，水楊酸的積累可激活NPR1與TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用，引起下游抗病基因的表達[16]。本研究發(fā)現(xiàn)橡膠HbNPR1基因在水楊酸、茉莉酸甲酯和乙烯誘導(dǎo)下表達量都升高，且不同時間段其表達差異顯著，但水楊酸處理下的表達量明顯的高于茉莉酸甲酯和乙烯，在處理24 h表達豐度達到最高值，推測該基因在橡膠樹的3個信號途徑中都能起到調(diào)控的作用，但所起的作用可能各不相同。然而HbNPR1基因在橡膠樹體內(nèi)是如何平衡和調(diào)節(jié)不同信號途徑誘發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)以及這些信號途徑是如何互相協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的還有待進一步的研究。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹抗?。↖AN873）和感病（PR107）種質(zhì)受多主棒孢病菌侵染后HbNPR1基因的表達存在明顯差異，抗病品種的表達豐度高于感病品種，且不同的時間段抗病品種的表達量都略高于感病品種，這是否能說明HbNPR1基因在不同抗性水平的橡膠種質(zhì)中的表達模式也存在一定的差異？這些結(jié)果有助于進一步明確HbNPR1基因在橡膠樹抗病途徑中的作用機制。

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責(zé)任編輯：凌青根