巴西橡膠樹HbDRM的克隆與表達(dá)分析

汪晗等

摘 要 運(yùn)用PCR和RACE技術(shù)從巴西橡膠樹中克隆出了一個(gè)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（Domains rearranged methyltransferase， DRM）基因（HbDRM）。HbDRM全長(zhǎng)為2 245 bp，含有1 917 bp的閱讀框，145 bp的 5′-UTR和176 bp 3′-UTR，編碼638個(gè)氨基酸，分子量為71.39 ku，等電點(diǎn)為4.90。HbDRM的氨基酸序列與可可、葡萄、黃瓜、鷹嘴豆、番茄、擬南芥DRM家族成員的同源性分別為77%、74%、72%、67%、64%和52%。定量RT-PCR分析表明HbDRM在巴西橡膠樹的根、樹皮、葉、花、膠乳、胚和愈傷組織中均有表達(dá)，其中在花和愈傷組織中表達(dá)量較高，在膠乳中表達(dá)量最低，此外HbDRM在橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系的膠乳中表達(dá)比其供體膠乳中的表達(dá)低。HbDRM的克隆和表達(dá)分析為下一步研究HbDRM在巴西橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系高產(chǎn)中的作用打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；域重排甲基轉(zhuǎn)移酶；DNA甲基化；自根幼態(tài)無(wú)性系；克隆與表達(dá)

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The full-length cDNA encoding a domains rearranged methyltransferase， designated HbDRM，was isolated from rubber tree by using PCR and RACE techniques. HbDRM was 2 245 bp in length and contained an open reading frame of 1917 bp. Sequence analysis revealed that the ORF of HbDRM encoded 638 amino acid residues with apredicted molecular mass of 71.39 ku. The deduced amino acid sequences of HbDRM showed high identities of 77%， 74%， 72%， 67%， 64% and 52% to those of the DRM from Theobroma cacao， Cucumis sativus， Cicer arietinum， Solanum lycopersicum and Arabidopsis thaliana. HbDRM expressed at different levels with the highest transcription in the flowers， followed by the callus and leaves. HbDRM transcript expressed at different levels with the lower in self-rooting juvenile clones than in their donor clones. The present study perhaps contributes towards an understanding of the molecular mechanism underlying high yielding in self-rooting juvenile clones.

Key words Hevea brasiliensis；Domains rearranged methyltransferase；DNA methylation；Self-rooting juvenile；Cloning and expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.016

表觀遺傳是指不因DNA序列的變化而形成的基因功能的改變，這種改變又可隨細(xì)胞的有絲分裂和/或減數(shù)分裂遺傳下去的現(xiàn)象[1]。表觀遺傳的分子機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)改型和小RNA干擾等。甲基化是一種主要表觀遺傳修飾形式，是調(diào)節(jié)基因功能的重要手段[2]。通過一系列DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)建立和維持DNA甲基化模式[3]。在植物DNA的甲基化過程中，目前發(fā)現(xiàn)至少有3類在結(jié)構(gòu)和功能上不同的胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶[3-5]：第1類是MET1（Methyltransferase， MET），甲基轉(zhuǎn)移酶家族，其主要功能是作為維持DNA的甲基化，也可能在DNA重新甲基化中起作用[6-7]；第2類是染色質(zhì)甲基化酶（Chromomethylase， CMT），是植物特有的一種甲基化酶，可以選擇性的對(duì)異染色質(zhì)區(qū)域DNA甲基化[8]；第3類則是域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（Domains Rearranged Methyltransferase， DRM），與哺乳動(dòng)物的從頭甲基轉(zhuǎn)移酶（de novo methyltransferase 3， DNMT3）相似，主要參與RNA指導(dǎo)的DNA甲基化[9-11]。

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料，巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）作為一種重要的產(chǎn)膠植物，是天然橡膠主要的商業(yè)來(lái)源，是熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物。巴西橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系是以橡膠樹花藥為外植體經(jīng)過組織培養(yǎng)得到的再生植株[12-13]。大量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明同一品系的自根幼態(tài)無(wú)性系橡膠樹的產(chǎn)量比相應(yīng)的供體（老態(tài)無(wú)性系）可提高20%～50%[13-16]，但對(duì)橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系高產(chǎn)的機(jī)制方面的研究目前還很少，歸納起來(lái)自根幼態(tài)無(wú)性系高產(chǎn)的構(gòu)成因子主要有：較快的生長(zhǎng)速度、較多的乳管列數(shù)目、較好的排膠和產(chǎn)膠生理特性[14]。Yuan等[17]對(duì)第5割年自根幼態(tài)無(wú)性系及其供體樹樹皮結(jié)構(gòu)和生物特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)幼態(tài)無(wú)性系的莖圍增大、乳管層數(shù)增多、干膠含量提高、堵塞指數(shù)和黃色體破裂指數(shù)變低、膠乳糖和無(wú)機(jī)磷含量提高。王澤云等[18]認(rèn)為自根幼態(tài)無(wú)性系的膠乳再生能力和排膠性能均顯著優(yōu)于老態(tài)無(wú)性系是高產(chǎn)的生理基礎(chǔ)，而這種差異的實(shí)質(zhì)是相關(guān)基因表達(dá)在時(shí)空和強(qiáng)度上的差異。李輝亮[19]證實(shí)了橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系與老態(tài)無(wú)性系基因組DNA之間存在甲基化多態(tài)性的差異，此外發(fā)現(xiàn)在自根幼態(tài)無(wú)性系和老態(tài)無(wú)性系的膠乳中存在基因和蛋白的差異表達(dá)[20-25]，但造成差異的根本原因還不清楚。橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系與供體的遺傳背景沒有差異，也就是說所含遺傳物質(zhì)DNA在堿基序列上應(yīng)該是相同的，因此自根幼態(tài)無(wú)性系與其供體之間所表現(xiàn)出的差異，很可能與表觀遺傳修飾中的DNA甲基化相關(guān)。

為了研究橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系高產(chǎn)與DNA甲基化的關(guān)系，本課題組對(duì)橡膠樹的3類胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了相關(guān)的研究。本研究將報(bào)道巴西橡膠樹DRM基因（HbDRM）的克隆和表達(dá)，該結(jié)果為進(jìn)一步研究橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系高產(chǎn)與DNA甲基化的關(guān)系打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)選用巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）海墾2號(hào)自根幼態(tài)無(wú)性系及其供體老態(tài)無(wú)性系，用于差異表的幼態(tài)無(wú)性系和老態(tài)無(wú)性系的膠乳采于同一時(shí)間，采自同一試驗(yàn)田的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，樹齡相同的植株。膠乳的采樣按照參考文獻(xiàn)[26]進(jìn)行，用液氮收集。葉片、花、根、樹皮、芽、胚和愈傷組織采集后用液氮研磨后最終于-70 ℃保存待用。

1.1.2 質(zhì)粒、菌種及試劑 Taq DNA Polymerase購(gòu)于Fermentas公司，T4-DNA連接酶、RNA PCR（AMV）Ver.3.0、5′和3′-full RACE Core Set購(gòu)自TaKaRa公司。IPTG、X-gal、dNTPs購(gòu)于Promega 公司。E.coli DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 橡膠樹膠乳、葉片、花、根、樹、芽、胚和愈傷組織的RNA提取參照按照參考文獻(xiàn)[27]的方法進(jìn)行。

1.2.2 HbDRM的5′和3′RACE擴(kuò)增 用于5′和3′RACE擴(kuò)增的cDNA的合成按5′和3′full RACE Core Set（TaKaRa 公司）試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室獲得的HbDRM片段序列設(shè)計(jì)5′和3′RACE引物用于5′和3′RACE擴(kuò)增。引物分別為5P1：5′-C

CATCATAATCTGAAGACCAGTGATCAG-3′；5P2：5′-CCATTTTCCTGAATTGCTTCAGCAACC-3′。3P1：5′-TGCCGTAAATGGAATCTGGTATGGGTG-3′；3P2：5′-GCTTTTGGGTTTCCCTAGGAACCATAC-3′。5′和3′RACE擴(kuò)增按照5′和3′-full RACE Core Set試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 HbDRM閱讀框序列的PCR擴(kuò)增 利用DNAMAN軟件對(duì)HbDRM片段、3′-RACE和5′-RACE獲得的片段拼接，根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HbDRM閱讀框序列。引物為F1：5′-ATGGATG

GAGATTCGTTTTGTG-3′；R1：5′-TCAATTTCTA GTCATTATACACT-3′。PCR反應(yīng)體系，94 ℃預(yù)變性3 min后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 35 s，32個(gè)循環(huán)，再繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物的克隆按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南的方法進(jìn)行，測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成[27]。

1.2.4 HbDRM的同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建 利用DNAMAN軟件分析HbDRM蛋白與其它植物的DRM家族同源性和進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.5 HbDRM熒光定量分析 熒光定量采用SYBR Premix Ex TaqⅡ，以HbACT基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照。用于qPCR的引物 qF：5′-GGTGGGAGTCCAT

GCAATAATC-3′；qR：5′-CCAAGTCTAGAATGCG ACAGAAAT-3′。actinF：5′-CAGTGGTCGACAACTG

GTAT-3′；actinR：5′-ATCCTCCAATCCAGACACT GT-3′。反應(yīng)條件為開始在95 ℃預(yù)變性 30 s然后按95 ℃ 5 s、 60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量按BIO-RAD CFX96熒光定量?jī)x使用說明進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbDRM的克隆

通過對(duì)其它植物中的DRM的同源比對(duì)分析，獲得了DRM家族保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物通過PCR獲得了橡膠樹DRM基因的片段，根據(jù)該片段設(shè)計(jì)RACE引物，通過3′-RACE和5′-RACE技術(shù)分別得到一個(gè)1 161 bp的片段和一個(gè)919 bp的片段。利用DNAMAN軟件對(duì)橡膠樹DRM基因片段、3′-RACE和5′-RACE獲得的片段拼接，得到長(zhǎng)2 245 bp的序列（命名為HbDRM）。該序列含有1 917 bp的閱讀框架，此外有145 bp的5′非編碼區(qū)和176 bp的3′非編碼區(qū)，在3′端非編碼區(qū)存在一個(gè)15個(gè)堿基的polyA尾（圖1）。根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)HbDRM的閱讀框架進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果與拼接結(jié)果完全一致，表明拼接結(jié)果正確。

2.2 HbDRM生物信息學(xué)分析

將推導(dǎo)的HbDRM蛋白序列進(jìn)行BLASTp分析，發(fā)現(xiàn)HbDRM蛋白與可可（Theobroma cacao）、葡萄（Vitis vinifera）、黃瓜（Cucumis sativus）、鷹嘴豆（Cicer arie-tinum）、番茄（Solanum lycopersicum）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）等物種的DRM家族成員具有較高的同源性，分別為77%、74%、72%、67%、64%和52%（圖2）。進(jìn)一步將HbDRM蛋白與其它植物的DRM家族成員進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)HbDRM與可可的DRM親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.3 HbDRM的組織特異性表達(dá)

為分析HbDRM的組織表達(dá)特性，對(duì)HbDRM在橡膠樹的根、皮、花、葉、膠乳、胚和愈傷組織的表達(dá)進(jìn)行了定量PCR分析。結(jié)果表明HbDRM在所測(cè)試的組織中均有表達(dá)，其中在花和愈傷組織中表達(dá)量相對(duì)較高，在膠乳中表達(dá)量最低（圖4）。

2.4 HbDRM在自根幼態(tài)無(wú)性系與其供體膠乳的差異表達(dá)

乳管是天然橡膠合成的場(chǎng)所，膠乳實(shí)質(zhì)上是乳管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。為了分析自根幼態(tài)無(wú)性系與其供體乳管細(xì)胞中HbDRM的表達(dá)是否存在差異，對(duì)HbDRM在自根幼態(tài)無(wú)性系與其供體膠乳的表達(dá)進(jìn)行了定量PCR分析。結(jié)果表明HbDRM在自根幼態(tài)無(wú)性系的表達(dá)比其供體膠乳的表達(dá)低（圖5）。

3 討論

DRM基因已經(jīng)從擬南芥、水稻和煙草等植物中克隆，并進(jìn)行了相關(guān)分析[28-31]，但是到目前為止還未見橡膠樹DRM基因的研究報(bào)道。本研究首次克隆了橡膠樹中DRM基因HbDRM，對(duì)其編碼的氨基酸與其它植物的DRM的同源性和分子進(jìn)化進(jìn)行分析，推導(dǎo)HbDRM是一種與植物DNA甲基化相關(guān)的域重排甲基轉(zhuǎn)移酶。

DNA甲基化可調(diào)控特定的內(nèi)源基因表達(dá)，而植物啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化通常抑制轉(zhuǎn)錄[1，4]。域重排甲基轉(zhuǎn)移酶DRM在RNA指導(dǎo)的DNA甲基化中起重要作用[9-11]。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)，不同組織的基因是選擇性表達(dá)的，意味不同組織基因甲基化狀態(tài)是不同的。本研究發(fā)現(xiàn)HbDRM在不同組織中差異表達(dá)，表明不同組織中DNA甲基化水平存在差異。此外HbDRM在自根幼態(tài)無(wú)性系的表達(dá)比其供體膠乳的表達(dá)低，可能造成自根幼態(tài)無(wú)性系和供體乳管細(xì)胞中DNA甲基化的差異，使得自根幼態(tài)無(wú)性系和供體乳管細(xì)胞中基因的表達(dá)出現(xiàn)差異，這一結(jié)果進(jìn)一步支持李輝亮[19]提出的DNA甲基化修飾是自根幼態(tài)無(wú)性系與其供體差異產(chǎn)生的重要原因的推斷。目前還不清楚HbDRM在巴西橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系高產(chǎn)中的作用，HbDRM基因的克隆和表達(dá)分析為下一步研究HbDRM在巴西橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系高產(chǎn)中的作用打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Russo V E A， Martienssen R A， Riggs A D.Epigenetic mechanisms of gene regulation[M]. Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N Y， 1996：123-130.

[2] Zemach A， McDaniel I E， Silve P， et al. Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation[J]. Science， 2010， 328： 916-919.

[3] Goll M G， Bestor T H. Eukaryotic cytosine methyltransferases [J]. Annual Review Biochem， 2005， 74： 481-514.

[4] Finnegan E J， Kovac KA. Plant DNA methyltransferases[J]. Plant Mole Biol， 2000， 43： 189-201.

[5] Pavlopoulou A， Kossida S. Plant cytosine-5 DNA methyltransferases： structure， function and molecular evolution[J]. Genomics， 2007， 90： 530-541.

[6] Kishimoto N， Sakai H， Jackson J， et al. Site specificity of the Arabidopsis METI DNA methyltransferase demonstrated through hypermethylation of the Superman locus[J]. Plant Mol Biol， 2001， 46： 171-183.

[7] Chan S W， Henderson I R， Jacobsen S E. Gardening the genome： DNA methylation in Arabidopsis thaliana[J]. Nature Reviews Genetics， 2005， 6： 351-360.

[8] Henikoff S， Comai L. A DNA methyltransferase homolog with a chromodomain exists in multiple polymorphic forms in Arabidopsis[J]. Genetics， 1998， 149： 3 007-3 018.

[9] Cao X， Springer N M， Muszynski M， et al. Conserved plant genes with similarity to mammalian de novo DNA methyltranferases[J]. Proc Nat Acad Sci USA， 2000， 97： 4 979-4 984.

[10] Cao X， Jacobsen S E. Role of the Arabidopsis DRM methyltransfeases in de novo methylation and gene silencing [J]. Current Biol， 2002， 12： 1 138-1 144.

[11] Chan S W， Zilberman D， Xie Z， et al. RNA silencing genes control de novo DNA methylation[J]. Science， 2004， 303： 1 336.

[12] 王澤云， 曾憲松， 陳傳琴. 從離體花藥誘導(dǎo)巴西橡膠植株[J]. 熱帶作物科技通訊， 1978（4）： 1-7.

[13] 陳雄庭， 王澤云， 吳蝴蝶， 等. 橡膠樹新種植材料-幼態(tài)自根無(wú)性系[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2002， 23： 19-23.

[14] 郝秉忠， 吳繼林. 巴西橡膠樹幼態(tài)無(wú)性系的高產(chǎn)特性[J]. 熱帶作物研究（熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)）， 1996， 16（2）： 1-8.

[15] 幼態(tài)課題組. 幼態(tài)無(wú)性系在生產(chǎn)上的應(yīng)用[J]. 熱帶作物研究（熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)）， 1994， 14（2）： 1-3.

[16] 張治禮，鄭學(xué)勤. 樹木發(fā)育階段理論及其在橡膠樹育種中的應(yīng)用[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2001， 9（3）： 262-268.

[17] Yuan X H， Yang S Q， Xu L Y. Characteristics related to higher rubber yield of Hevea brasiliensis juvenile-type clone GL1[J]. J Rubber Res， 1998（1）： 125-132.

[18] 王澤云， 陳雄庭，吳胡蝶. 橡膠樹新型種植材料——體胚植株[J]. 熱帶作物研究（熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)）， 2001， 21（6）： 11-15.

[19] 李輝亮. 橡膠樹自根幼態(tài)無(wú)性系與其供體（老態(tài)無(wú)性系）差異的分子基礎(chǔ)研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2010.

[20] 魯惠中， 李輝亮， 郭 冬， 等. 巴西橡膠樹HbHDT1基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（1）： 59-64.

[21] 李輝亮， 郭 冬， 彭世清. 巴西橡膠樹14-3-3蛋白基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（9）： 1 452-1 457.

[22] 梁小蓮， 李輝亮，彭世清. 巴西橡膠樹HbTCTP基因的克隆及表達(dá)[J]. 分子植物育種， 2009（1）： 188-193.

[23] Li H L， Lu H Z， Guo D， et al. Molecular characterization of a thioredoxin hgene（HbTRX1）from Hevea brasiliensis showing differential expression in latex between self-rooting juvenile clones and donor clones[J]. Mol Biol Rep， 2011， 38： 1 989-1 994.

[24] Li H L， Wang Y， Guo D， et al. Three MADS-box genes of Hevea brasiliensis expressed during somatic embryogenesis and in the laticifer cells[J]. Mol Biol Rep， 2011， 38： 4 045-4 052.

[25] Li H L， Guo D， Lan F Y， et al. Protein differential expression in the latex from Hevea brasiliensis between self-rooting juvenile clones and donor clones[J]. Acta Physiol Plant， 2011， 33： 1 853-1 859.

[26] Tang C， Qi J， Li H， et al. A convenient and efficient protocol for isolating high-quality RNA from latex of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. J Biochem Biophys Methods， 2007， 70： 749-754.

[27] 黃培堂. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第3版[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2002： 372-475.

[28] Naumann U， Daxinger L， Kanno T， et al. Genetic evidence that DNA methyltransferase DRM2 has a direct catalytic role in RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis thaliana[J]. Genetics， 2011， 187： 977-979.

[29] Moritoh S， Eun CH， Ono A， et al. Targeted disruption of an orthologue of DOMAINS REARRANGED METHYLASE 2， OsDRM2， impairs the growth of rice plants by abnormal DNA methylation[J]. Plant J， 2012， 71： 85-98.

[30] Wada Y， Ohya H， Yamaguchi Y， et al. Preferential de novo methylation of cytosine residues in non-CpG sequences by a domains rearranged DNA methyltransferase from tobacco plants[J]. J Biol Chem， 2003， 278： 42 386-42 393.

[31] Dangwal M， Malik G， Kapoor S， et al. De novo methyltransferase， OsDRM2， interacts with the ATP-dependent RNA helicase， OseIF4A， in rice[J]. J Mol Biol， 2013， 425： 2 853-2 866.