基于ITS2條形碼的南藥巴戟天真?zhèn)舞b別

黃瓊林等

摘 要 本研究旨在建立基于ITS2條形碼的巴戟天及其混偽品的真?zhèn)舞b別方法。采用試劑盒提取巴戟天植物樣品的總DNA，以一對(duì)通用引物對(duì)其ITS2條形碼進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序；從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取巴戟天及其混偽品ITS2序列。采用DNAMAN、ClustalX軟件拼接比對(duì)序列，以及利用MEGA5.1軟件構(gòu)建NJ樹。獲得的22條ITS2序列的長(zhǎng)度范圍為224～244 bp，GC含量范圍為59.8%～70.1%。巴戟天與8種混偽品的ITS2序列存在155處變異，種間K2P遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)K2P遺傳距離?；贗TS2條形碼的NJ聚類樹能直觀地區(qū)分巴戟天及其混偽品。因此，ITS2條形碼適用于南藥巴戟天及其混偽品的鑒別，可為其基原研究提供重要的分子鑒定證據(jù)。

關(guān)鍵詞 巴戟天；混偽品；ITS2條形碼；鑒別

中圖分類號(hào) S567.239 文獻(xiàn)識(shí)別碼 A

Identifying Morinda officinalis and Its Adulterants

Based on ITS2 Barcode

HUANG Qionglin1， ZHENG Xiasheng2， CAI Chun1*

1 Guangdong Medical College， Zhanjiang， Guangdong 542023， China

2 Guangzhou University of Chinese medicine， Guangzhou， Guangdong 510006， China

Abstract The study aimed to establish a novel identification method for Morinda officinalis and its adulterants based on ITS2 barcode. Genomic DNA was extracted from M. officinalis leaves kept in gel and ITS2 region was amplified and sequenced with a pair of universal primers. ITS2 sequences of M. officinalis and its adulterants acquired from plant materials and Genbank were assembled and aligned by DNAMAN and CLUSTALX， and the NJ tree was constructed using MEGA 5.1. Significant differences were observed in the ITS2 sequences between M. officinalis and its adulterants. The interspecific genetic distance was far more than the intraspecific distance. NJ tree based on ITS2 sequences can distinguish M. officinalis and its adulterants intuitively. Therefore， ITS2 barcode could be used to identify M. officinalis and its adulterants effectively， and provide important molecular evidence for the authentication of germplasm resources.

Key words Morinda officinalis； Adulterants； ITS2 barcode； Identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.021

巴戟天是中國(guó)著名“四大南藥”之一，藥典收載正品來源于茜草科巴戟天屬植物巴戟天（Morinda officialis How.）的干燥肉質(zhì)根，味辛甘、性溫，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)，祛風(fēng)除濕，強(qiáng)筋健骨的功效，主治腎虛陽(yáng)萎、遺精早泄、少腹冷痛、小便不禁、宮冷不孕、風(fēng)寒濕痹、腰膝酸軟等癥[1]。由于藥食兩用的價(jià)值，巴戟天在民間和商業(yè)上均被廣泛利用和開發(fā)，但人工栽培無(wú)法滿足當(dāng)前的需求。市售巴戟天藥材頻頻出現(xiàn)偽品，如同屬的假巴戟Morinda shuanghuaensis、雞眼藤M(fèi)orinda parvifolia、羊角藤M(fèi)orinda parvifolia等，這些物種的形態(tài)與巴戟天極為相似，僅靠傳統(tǒng)鑒定技術(shù)無(wú)法完全將其區(qū)別。這些混偽品的成分與巴戟天存在較大差異，功效不盡相同，它們的存在對(duì)巴戟天的臨床用藥造成很大的安全隱患，也制約了巴戟天產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化的進(jìn)程。

由于傳統(tǒng)方法對(duì)巴戟天真?zhèn)舞b別存在不足，前人也已采用DNA序列分析進(jìn)行巴戟天及其偽品的鑒別。丁平等[2]利用ITS序列對(duì)巴戟天與3個(gè)偽品（假巴戟、羊角藤和虎刺Damnacanthus indicus）進(jìn)行鑒別，但是ITS序列較長(zhǎng)，對(duì)DNA質(zhì)量要求高，PCR擴(kuò)增和序列分析難度較大。姬生國(guó)等[3]分析了巴戟天及樟葉巴戟Morinda cinnamomifoliata等4個(gè)偽品的psbA-trnH序列差異，但變異水平低，容易產(chǎn)生誤差，在一定程度上不利于更多樣品的鑒別。因此，有必要在更廣泛樣本的基礎(chǔ)上建立簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的巴戟天真?zhèn)舞b別方法。

本文利用當(dāng)前熱門的藥用植物DNA條形碼——核內(nèi)第二轉(zhuǎn)錄間區(qū)（secondary internal transcribed space， ITS2）對(duì)巴戟天及其8種混偽品進(jìn)行鑒別，為其臨床用藥安全和資源保護(hù)提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的ITS2序列來源于植物樣品實(shí)驗(yàn)或Genbank下載（表1）。植物樣品采集于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城校區(qū)藥王山，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室童家赟講師鑒定，取其葉片置硅膠中保存?zhèn)溆谩?/p>

植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技公司；PCR試劑、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Markers購(gòu)自大連寶生物工程公司；引物合成和測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司完成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序 巴戟天葉片總DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。利用ITS2條形碼特異性引物（上游：5′-ATGCGAT

ACTTGGTGTGAAT-3′；下游：5′-GACGCTTCTCCA

GACTACAAT-3′）[4]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中10×Ex Taq buffer 5 μL、dNTP（10 mmol/L）3.0 μL、正反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、Ex Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，用滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 0.5 min，52 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.0 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化后送樣測(cè)序。

1.2.2 序列分析 采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，基于隱馬爾可夫模型的HMM方法（http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）獲取純ITS2區(qū)序列[5]，并采用Bankit軟件向Genbank提交植物樣品實(shí)驗(yàn)所獲序列；利用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)；采用MEGA5.1軟件分析基于ITS2序列的供試物種間遺傳距離，并構(gòu)建基于Kimura 2-parameter （K2P）模型和Neighbor-Joining（NJ）鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（1 000次重復(fù)bootstrap檢驗(yàn)各分支的支持率）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

由于本研究采集的巴戟天植物樣本存在生長(zhǎng)年限、生長(zhǎng)階段以及化學(xué)成分含量等差異，利用通用植物DNA提取試劑盒提取的巴戟天DNA效果不盡相同，但巴戟天DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳上均顯現(xiàn)出目的條帶（圖1），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

以上述巴戟天DNA樣品為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得約500 bp的ITS2片段（圖2），與預(yù)期相符合。將PCR產(chǎn)物純化后送樣測(cè)序，并將獲得的序列提交Genbank（登記號(hào)見表1中的KJ000533、KJ000534）。

2.2 序列差異分析

本研究所獲巴戟天及其混偽品ITS2序列共有22條，序列長(zhǎng)度為224～244 bp，GC含量范圍為59.8%～70.1%。所有ITS2序列比對(duì)后的長(zhǎng)度為253 bp，其中巴戟天及其8種混偽品存在155處變異，鑒別信息位點(diǎn)為151個(gè)；巴戟天的7條序列僅存在2處變異，分別為26 bp的C-T和46 bp的G-A變異（圖3），表明巴戟天與偽品間的差異程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于巴戟天種內(nèi)變異水平。

2.3 遺傳距離分析

基于K2P模型計(jì)算的巴戟天及其混偽品遺傳距離如表2所示，巴戟天種內(nèi)K2P遺傳距離為0.005～0.010。在種間，最大的種間K2P遺傳距離來源于巴戟天與鐵箍散，達(dá)0.771，最小的種間遺傳距離則來自巴戟天與同屬的假巴戟天和羊角藤，為0.025。巴戟天與偽品間的遺傳距離遠(yuǎn)大于巴戟天種內(nèi)遺傳距離，說明在ITS2序列中有足夠的差異鑒別巴戟天以及混偽品。

2.4 聚類分析

基于ITS2條形碼構(gòu)建的巴戟天與8種混偽品的聚類樹如圖4所示，22個(gè)樣品主要聚成4個(gè)分支。巴戟天的全部樣品首先單獨(dú)聚在一起，然后再與同屬的假巴戟、羊角藤和雞眼藤聚成一支，隨后再與同科虎刺屬的虎刺、短刺虎刺聚集，這與傳統(tǒng)分類結(jié)果相一致。其余3種偽品與巴戟天差異較大，另外聚成2個(gè)分支。各分支支持率均在90%以上，表現(xiàn)出明顯的單系性，而且區(qū)分效果良好，可見ITS2條形碼能夠很好鑒定巴戟天及其混偽品。

3 討論與結(jié)論

DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)在2003年由分類學(xué)家Hebert等[6]提出，是利用一段較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列來實(shí)現(xiàn)物種的快速、準(zhǔn)確鑒別。迄今為止，已有多種核片段和質(zhì)體基因及其組合被提議為植物DNA條形碼[7]。其中，ITS2條形碼在來源于753個(gè)屬4 800個(gè)種的6 000余個(gè)藥用植物樣品的鑒定成功率高達(dá)92.7%，被認(rèn)為是藥用植物通用DNA條形碼[4]。目前，ITS2條形碼已經(jīng)廣泛應(yīng)用于砂仁[8]、青天葵[9]、兩面針[10]等多種嶺南道地藥材的真?zhèn)舞b別。本研究利用變異程度較大的ITS2條形碼也成功區(qū)別巴戟天及其8種常見混偽品，而且ITS2條形碼長(zhǎng)度較短（250 bp左右），大大降低了DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序的難度，有利于發(fā)生降解的藥材樣品的序列獲取。

DNA條形碼技術(shù)以物種遺傳信息為鑒別依據(jù)，不受物種發(fā)育階段和藥材狀態(tài)的限制，擺脫了傳統(tǒng)鑒定方法對(duì)專業(yè)背景的要求，有利于非分類學(xué)專業(yè)人員對(duì)中藥材進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。陳士林[11]應(yīng)用ITS2條形碼等序列完成了2010版《中國(guó)藥典》中200多味中藥材的真?zhèn)舞b別，而且國(guó)家藥典委員會(huì)在2012年公布了《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》，說明DNA條形碼具有良好的推廣和應(yīng)用價(jià)值。DNA條形碼或會(huì)接棒傳統(tǒng)鑒別方法，這將是中藥分子鑒定方法學(xué)上的創(chuàng)新，對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)藥的國(guó)際化也有著推動(dòng)作用。

本研究建立起巴戟天及其混偽品基于ITS2條形碼的鑒別體系，為巴戟天的真?zhèn)舞b別和用藥安全提供了保障，也可為DNA條形碼作為藥典收載巴戟天鑒別標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[S]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2010： 75-76.

[2] 丁 平， 方 琴. 巴戟天與常見混偽品的rDNA-ITS序列分析及其分子鑒定[J]. 中草藥， 2005， 36（6）： 908-912.

[3] 姬生國(guó)， 王 東， 張春榮， 等. 巴戟天及其偽品的psbA-trnH序列鑒定[J]. 廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011， 27（3）： 253-255.

[4] Shen S L， Yao H， Han J P， et al. Validation of The ITS2 Region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PloS One， 2010， 5（1）： e8 613.

[5] Schultz J， Müller T， Achtziger M， et al. The internal transcribed spacer 2 database-a web server for（not only）low level phylogenetic analyses[J]. Nucleic Acids Res， 2006（34）： 704-707.

[6] Hebert P D N， Gregory T R. The promise of DNA barcoding for taxonomy[J]. Syst Biol， 2005， 54（5）： 852-859.

[7] Fiser Pecnikar Z， Buzan E V. 20 years since the introduction of DNA barcoding： From theory to application[J]. J Appl Genet， 2013， 55（1）： 43-52.

[8] 韓建萍， 李美妮， 石林春， 等. 砂仁及其混淆品的ITS2序列鑒定[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥， 2011， 4（2）： 99-102.

[9] 黃瓊林， 馬新業(yè)， 何 瑞， 等. 基于條形碼ITS2序列的青天葵及其混偽品分子鑒別[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2012（12）： 173-181.

[10] 陳貝貝， 宋經(jīng)元， 姚 輝， 等. 基于ITS條形碼的兩面針?biāo)幉募捌浠靷纹返蔫b別[J]. 中草藥， 2013， 43（15）： 2 150-2 154.

[11] 陳士林. 中藥DNA條形碼分子鑒定[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2012.

責(zé)任編輯：黃 艷